رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة ²⁺ الاستشعار الماسك ⁺

الهدف العام من هذه التجربة هو عرض بروتوكولاتنا الخاصة بثقافة وتعداء خلايا HEK293 و C2C12 باستخدام CatchER plus وتطبيقها لمراقبة عابرات الكالسيوم بوساطة مستقبلات ERSR في قياس NC2KD. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في إشارات الكالسيوم والتصوير مثل تركيز الكالسيوم القاعدي وتغييراته السريعة في ERSR للخلايا المحددة وكيفية تطبيق المستشعر الحيوي CatchER plus لهذه القياسات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تسجيل استجابة التألق للخلايا المفردة في الوقت الفعلي باستخدام الحركية السريعة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص الأمراض المرتبطة بالكالسيوم ERSR لأن CatchER plus يمكنه مراقبة عابرات الكالسيوم غير الطبيعية في هذه العضيات التي تنشأ من عناصر إشارات كالسيوم المختلة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تعداء الخلية والتصوير الفلوري لأن زراعة الخلايا والفحص المجهري لهما مجالات متعددة للخطأ. ستظهر الإجراء فلورنس ريديش ، وهي طالبة ما بعد الدكتوراه من مختبرنا.

لبدء هذه التجربة ، قم بزرع خلايا HEK293 على المجهر الزجاجي المعقم في أطباق وزراعة ستة سنتيمترات لمدة يوم إلى يومين حتى تتماسك حوالي 70٪ في يوم التعداد. بعد ذلك ، أفرغ DMEM من الطبق وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط المصل المخفض. بعد ذلك ، أضف خليط كاشف تعداء الحمض النووي إلى الطبق واحتضانه لمدة أربع إلى ست ساعات عند 37 درجة مئوية.

تعداء خلايا HEK293 أسهل بشكل عام من خطوط الخلايا الأخرى ، لكن الخلايا أقل مرونة في الظروف القاسية. لذلك ، من الأهمية بمكان تعريضهم فقط لكواشف التعدي لمدة أربع إلى ست ساعات لتجنب موت الخلايا المبرمج. بعد أربع إلى ست ساعات ، اغسل الخلايا بخمسة إلى ستة ملليلتر من HBSS.

تخلص من HBSS من الطبق واستبدلها بثلاثة ملليلتر من DMEM الطازج. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير عن GECI. بالنسبة لخلايا الأرومة العضلية C2C12 ، قم بتربسين الخلايا عن طريق إضافة واحد إلى ملليلترين من التربسين لتغطية قاع الطبق.

بعد ذلك ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ست دقائق للسماح للتربسين بفك الخلايا من قاع الطبق. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة التربسين وشفط الخلايا في ثمانية ملليلتر من DMEM. قم بسحب الخلايا جيدا باستخدام DMEM لتفريق الخلايا وإعادة تعليقها بالتساوي.

بعد ذلك ، قم بزرعها على أغطية معقمة في أطباق مزرعة بحجم ستة سنتيمترات ثم أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM لتحقيق التقاء نهائي بنسبة 60٪ بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا في نفس اليوم. احتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بخمسة إلى ستة ملليلتر من HBSS.

تخلص من HBSS من الطبق واستبدلها بثلاثة ملليلتر من DMEM الطازج. ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للسماح بالتعبير عن GECI. في هذا الإجراء ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء ، ثم افتح برنامج PCI البسيط.

باستخدام قطعة قطن ، قم بتغطية الجزء السفلي من غرفة تصوير الحمام المفتوحة ذات الماس المفتوح بطبقة رقيقة من مادة مانعة للتسرب. بعد ذلك ، خذ شريحة تحتوي على الخلايا المنقولة من الحاضنة واشطفها برفق ثلاث مرات بحوالي ملليلتر واحد من محلول رينجر مع 10 مللي مولار جلوكوز و 1.8 ملليمولار كالسيوم مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. اترك ما يقرب من ملليلتر واحد من مخزن Ringer المؤقت في الطبق لمنع الخلايا من الجفاف واستخدم الملقط لإخراج الشريحة من الطبق.

امتصاص المحلول الزائد عن طريق لمس حافة الشريحة بأنسجة المختبر. ثم ضعه على جانب الغرفة بحيث تكون الخلايا متجهة نحو الشحوم. بعد ذلك ، قم بتأمين الغرفة على حامل المسرح باستخدام مفك البراغي.

أضف حوالي مليلتر واحد من مخزن Ringer المؤقت إلى الغرفة لمنع الخلايا من الجفاف أثناء تركيبها على المسرح وإكمال إعداد المجهر. قم بتبديل هدف المجهر إلى هدف غمر الزيت 40 مرة. أضف قطرة واحدة من زيت الغمر إلى الهدف.

بعد ذلك ، ضع الحامل على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، ضع طرف الفراغ في الغرفة للحفاظ على المحلول مستوي ومنعه من الإفراط في التعبئة. بعد ذلك ، ارفع الهدف باستخدام تعديل الدورة التدريبية حتى يلامس الزيت الموجود على الهدف الجزء السفلي من الشريحة.

باستخدام وضع المجال الساطع ، اضبط الكسب على 175 ووقت التعريض الضوئي إلى 0.03 ثانية لتركيز الخلايا. بمجرد تركيز الخلايا ، قم بالتبديل إلى وضع التألق باستخدام إثارة 488 نانومتر وقم بتغيير وقت التعرض إلى 0.07 ثانية. حدد موقع مجال رؤية يحتوي على خلايا كافية صحية مع مضان مناسب للتصوير.

ثم التقط صورا في وضع التألق والمجال الساطع. ضع دائرة حول منطقة ذات أهمية في الخلايا أو ضع دائرة حول الخلية بأكملها لتسجيل الشدة من المنطقة المختارة. الآن ، ابدأ قياس الشدة مع ضبط معدل الإطارات على واحد كل خمس ثوان.

اسمح لكثافة خط الأساس بالاستقرار لمدة 20 إلى 30 إطارا. بعد ذلك ، احسب كمية 4-CMC اللازمة من مخزون 20 مليمولار بناء على حجم الغرفة النهائي البالغ 450 ميكرولتر لعمل تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومولار. بعد ذلك ، انقل بعناية 60 ميكرولترا من مخزن Ringer المؤقت من الغرفة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

بتخفيف الكمية المحسوبة من 4-CMC باستخدام هذا المحلول وأضفها مرة أخرى إلى الغرفة لاستحضار الاستجابة المقصودة من الخلايا التي يتم تصويرها. اترك وقتا للدواء للارتباط بالمستقبل وانخفاض الإشارة اللاحقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا بثلاثة إلى ستة ملليلتر من المخزن المؤقت ل Ringer مع إضافة علامة الحدث في نفس الوقت.

كرر الإجراءات الخاصة ب 100 ميكرومولار ATP و 15 ميكرومولار CPA باستخدام شريحة جديدة من الخلايا المنقولة لكل فحص. بمجرد اكتمال القياس ، قم بإنهاء جمع البيانات في نافذة قياس الشدة في برنامج PCI البسيط. بعد ذلك ، التقط الصور الفلورية والميدانية الساطعة للخلايا.

ثم افتح ملف البيانات للتجربة. أعد وضع دائرة حول الخلايا أو المناطق ذات الأهمية لإعادة حساب قيم الشدة إذا لزم الأمر. لتحديد خلايا الأرومة العضلية NC2KD و C2C12 ، كرر إجراء التعدي وأضف ملليلترا واحدا من عازلة Ringer الخالية من الكالسيوم في الغرفة.

قم باختراق الخلايا باستخدام 0.002 إلى 0.005٪ من الصابونين والمخزن المؤقت داخل الخلايا لمدة 15 إلى 30 ثانية لتفريغ الخلايا من أي CatchER plus قد يكون في العصارة الخلوية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا بثلاثة إلى ستة ملليلتر من المخزن المؤقت KCL الذي يحتوي على EGTA و 10 ميكرومولار أيونومايسين. اسمح للشدة بتقليل حتى الوصول إلى الهضبة.

بعد ذلك ، اشطف الخلايا بثلاثة إلى ستة ملليلتر من المخزن المؤقت KCL مع 10 ميكرومولار أيونوميسين واترك الكثافة تستقر بعد ذلك ، أضف محاليل الكالسيوم المختلفة للسماح للكثافة بالوصول إلى هضبة بين كل إضافة. لمعايرة المستشعر لقياس تركيز الكالسيوم القاعدي ، استخدم EGTA و 100 مللي مولار من الكالسيوم المخزن المؤقت للحصول على الحد الأدنى والحد الأقصى لشدة التألق.

تظهر هنا السمات التمثيلية للكثافة الطبيعية التي تم جمعها من خلايا الأرومة العضلية C2C12 المنفذة التي تم نقلها باستخدام CatchER plus. تم اختراق الخلايا بنسبة 0.005٪ من الصابونين في المخزن المؤقت داخل الخلايا لمدة 15 إلى 30 ثانية. تم تحضير EGTA ومحاليل الكالسيوم في محلول KCL ويشير N إلى عدد الخلايا المصورة.

هذه الصور الفلورية الداخلية هي ممثلة للخلايا قبل العلاج وبعده. تمت إضافة 0.2 و 0.6 و اثنان وخمسة و 10 و 20 و 50 و 100 مللي مولار من الكالسيوم إلى خلايا الأرومة العضلية C2C12 المنفذة في وجود 10 ميكرومولار أيونوميسين للحصول على دينار كويتي 3.1 زائد أو ناقص 1.4 مللي مولار. يوضح هذا الشكل قياسا تمثيليا للكثافة ل CatchER بالإضافة إلى الخلايا المنقولة عند القيم الدنيا والقصوى بعد إضافة EGTA مليمولي واحد و 100 مللي مولار من الكالسيوم مع 10 ميكرومولار أيونوميسين لكل منهما على التوالي.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 إلى 60 دقيقة للتصوير أو ثلاثة أيام إذا كانت تتضمن التعداد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما التعامل مع الخلايا في بيئة معقمة ، وتجهيز الكواشف قبل التجربة ، ووضع طبقة متساوية من الشحوم على الغرفة ، وتركيب المكنسة الكهربائية قبل البدء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل اللطخة الغربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مستوى التعبير عن CatchER plus.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إشارات الكالسيوم والتصوير لاستكشاف ديناميكيات الكالسيوم ERSR في خلايا الثدييات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل الخلايا وتصويرها باستخدام CatchER plus.