رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في ساكاروميسز سيريفيسياي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء خرائط على مستوى الجينوم لتفاعلات البروتين والحمض النووي في الموقع بدقة عالية وخلفية منخفضة ، دون الحاجة إلى تشابك الفورمالديهايد أو إذابة الكروماتين أو الأجسام المضادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النسخ ، مثل المكان الذي ترتبط فيه العوامل التنظيمية المختلفة بالكروماتين ، بالنسبة للمناطق التنظيمية الجينية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر خرائط ربط جينومية عالية الدقة بخلفية ضئيلة ، وتتجنب القيود المرتبطة ببروتوكولات ChEC-seq القياسية.

سيظهر الإجراء سيباستيان جرونبرغ ، زميلي من مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان. في فترة ما بعد الظهر أو المساء من اليوم السابق للتجربة ، ابدأ ثقافة مسبقة لسلالة الاستخدام التجريبي. تلقيح ثلاثة ملليلتر من سكر العنب الببتون المستخدم ، أو وسط انتقائي مناسب بمستعمرة واحدة من السلالة ، تحمل عامل MNase الموسوم.

احتضن هذه الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة شاكر 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة الليلية إلى 50 مل من الكثافة المتوسطة إلى الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من 0.2 إلى 0.3. احتضان المزرعة في حاضنة شاكر حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5 إلى 0.7.

قم بإعداد الكمية المطلوبة من إضافات Buffer A plus ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة أثناء العملية. تحضير أنابيب الطرد الدقيق لجمع العينات. لكل عامل جديد يتم تحليله ، اجمع عينات بدون إضافة الكالسيوم ، وأضف 30 ثانية ، ودقيقة واحدة ، و 2.5 دقيقة ، و 5 دقائق ، و 10 دقائق بعد إضافة الكالسيوم.

أضف إلى كل أنبوب 90 ميكرولتر من محلول التوقف ، و 10 ميكرولتر من 10٪ SDS. عندما تصل الثقافة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.5 إلى 0.7 ، قم بصب المزرعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا تماما في مليلتر واحد من Buffer A ، وانقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب ميكروفوج.

حبيبات الخلايا المعلقة في ميكروفوجي عند 1 ، 500 مرة جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا تماما في مليلتر واحد من Buffer A عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. حبيبات الخلايا المعلقة في 1 ، 500 مرة غرام لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من Buffer A ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد إزالة المادة الطافية ، قم بإعادة تعليق الخلايا تماما في 570 ميكرولتر من العازلة A.أضف 30 ميكرولتر من 2٪ ديجيتونين لتسهيل نفاذية الخلايا ، واقلبها للخلط. تخلل الخلايا في كتلة حرارية عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ماصة التفاعل لأعلى ولأسفل لضمان التوزيع المتساوي للخلايا. كعنصر تحكم سلبي ، قم بنقل 100 ميكرولتر من الخلايا المنفذة إلى أنبوب ميكرو فوج يحتوي على محلول توقف و SDS ، ودوامة لفترة وجيزة للخلط. قبل بدء المسار الزمني ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك أنابيب محلول التوقف والماصة وأطراف الماصة ومؤقت بجوار الكتل الحرارية بحيث يمكن جمع النقاط الزمنية المبكرة بكفاءة.

لبدء الدورة الزمنية ، أضف 1.1 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم أحادي المولار إلى الخلايا المنفذة لتنشيط MNase ، وقم بقلبها عدة مرات بسرعة للخلط. أعد التفاعل المختلط على الفور إلى 30 درجة مئوية وابدأ المؤقت. في كل نقطة زمنية يتم جمعها ، قم بسحب الماصة للتفاعل لأعلى ولأسفل لضمان التوزيع المتساوي للخلايا ، ثم قم بإزالة 100 ميكرولتر من الخلايا المنفذة إلى أنبوب ميكرو فوج يحتوي على محلول توقف و SDS.

دوامة لفترة وجيزة للخلط. بمجرد جمع جميع النقاط الزمنية ، أضف أربعة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K إلى كل عينة. دوامة لفترة وجيزة للخلط ، وتحتضن عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أضف 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى كل عينة ، والدوامة بقوة للخلط ، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. أضف 30 ميكروغراما من الجليكوجين ، و 500 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.

دوامة بقوة للخلط ، وترسيب على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق ، أو حتى يصبح المحلول لزجا. حبيبات الحمض النووي المترسب عن طريق الطرد المركزي بأقصى سرعة ، وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وغسل كل حبيبات بمليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة 70٪ من الإيثانول.

صب الإيثانول وإزالة الباقي عن طريق قلب الأنابيب برفق على منشفة ورقية. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة ، ثم استخدم ماصة لإزالة الإهتانول المتبقي ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. جفف الكريات في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أثناء تجفيف كريات الحمض النووي, اصنع مزيجا رئيسيا من المخزن المؤقت Tris و RNase A لإعادة تعليق الكريات بمجرد تجفيفها, ودوامة للخلط. أضف 30 ميكرولترا من محلول RNase A إلى كل حبيبات DNA مجففة ، دوامة للخلط ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لهضم RNa. بعد 20 دقيقة ، امزج ميكرولتر واحد من صبغة تحميل الحمض النووي 6X مع خمسة ميكرولترات من كل عينة ، وقم بتشغيلها على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ عند 120 فولت لمدة 40 دقيقة.

ابدأ إجراء اختيار الحجم بإضافة 75 ميكرولترا من حبات SPRI إلى كل عينة في محلول بولي إيثيلين جلايكول. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لخلط الخرزات وخليط الحمض النووي ، ثم تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء حضانة حبة SPRI ، قم بإعداد أنابيب ميكرو فوج تحتوي على 96 ميكرولتر من 10 ملليمولار Tris pH 8.0 ، وأربعة ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم المولار لكل عينة.

ضع الأنابيب التي تحتوي على الخرز وخليط الحمض النووي في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين لجمع الخرز على جانب الأنبوب ، ثم انقل كل مادة طافية إلى أنبوب جديد يحتوي على تريس وكلوريد الصوديوم. أضف 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل إلى كل عينة ، ودوامة للخلط ، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة كل مرحلة مائية إلى أنبوب جديد ، وأضف 30 ميكروغراما من الجليكوجين ، و 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.

ترسيب الحمض النووي على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق ، أو حتى يصبح المحلول لزجا. حبيبات الحمض النووي المترسب عن طريق الطرد المركزي بأقصى سرعة وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وغسل كل حبيبات بملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول.

صب الإيثانول ، وإزالة الباقي عن طريق قلب الأنابيب والنقر عليها برفق على منشفة ورقية. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة ، واستخدم ماصة لإزالة الإيثانول المتبقي ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. جفف الكريات في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق كل حبيبات مجففة في 25 ميكرولتر من Tris pH 8. حدد تركيز كل عينة باستخدام مقايسة عالية الحساسية. يكشف الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للحمض النووي من تحليل الانقسام الداخلي للكروماتين ل Reb1 ، وهو عامل تنظيمي عام يربط المناطق المستنفدة للنوكليوسوم ، عن زيادة تعتمد على الكالسيوم في تجزئة الحمض النووي بمرور الوقت كما يتضح من التلطيخ ، والهضم الكامل في نهاية المطاف للحمض النووي الجيني.

يكشف تصور نهايات الشظايا من تجربة تسلسل الانقسام الداخلي للكروماتين Reb1 عن إثراء قوي ل Reb1 على الخلفية ، مشتق من سلالة MNase الحرة بعد 30 ثانية من معالجة الكالسيوم. وبالمثل ، لوحظ انقسام كبير في الحمض النووي من خلال اندماج الوحدة الفرعية للوسيط Med8 مع MNase ، ولكن ليس حرة مدفوعة ب MNase بواسطة محفز Med8 بعد دقيقة واحدة من إضافة الكالسيوم. لمقارنة بيانات تسلسل الانقسام الذاتي للكروماتين Reb1 مع الترسيب المناعي للكروماتين وبيانات التسلسل عالي الإنتاجية ، تم تمركز 1 ، 992 قمم Reb1 التي تم تحديدها بواسطة الطريقة العضوية ، وتم تحديد متوسط عدد أطراف الأجزاء في كل موضع أساسي في نافذة 100 زوج أساسي حول نقطة المنتصف الحافز.

لوحظ عدم تناسق وانقسام مذهل مع غالبية نهايات الشظايا التي تم إصدارها من Reb1-MNase إلى الجانب العلوي من الشكل. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم عمل واحد كامل ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر الحد من عدد العينات التي يتم فحصها بالتوازي، لضمان أوقات سحب العينة والمناولة بدقة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال النسخ ، لأول مرة ، لتوصيف الارتباط الجيني لمركب بروتين بحجم ميجادالتون غير مرتبط بالحمض النووي في الخميرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تنفيذ طريقة ChEC-Seq لرسم الخرائط على مستوى الجينوم لمواقع ربط البروتين في جينوم الخميرة الناشئة.