طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر
ديسمبر 30, 2017
القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).
الهدف العام من هذا الإجراء هو طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة العذراء ذبابة الفاكهة مناسبة للكشف المناعي أو فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم تطوير الإجراء الموصوف هنا من خلال الطلب على إيجاد طريقة سريعة وفعالة للحصول على عينات جناح العذراء مناسبة لإجراء فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو بروتوكولات الكشف عن المناعة. باستخدام فرشاة رسم مبللة ، قم بإزالة خادرة APF بلطف من قوارير الاستزراع وضعها في قوارير جديدة لإكمال فترة التطوير.
على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم خادرة 24 ساعة APF ، فستترك في القارورة لمدة 22 ساعة فقط. في غضون 22 ساعة ، انقل الخادرة إلى شريحة المجهر مع لصق الشريط على الوجهين بها. يمكن إجراء هذا النقل باستخدام فرشاة الرسم لتجنب إتلاف الخادرة.
يجب وضع الخادرة لتشكيل صف مع الجوانب الظهرية لأعلى ونهايات رأسية تواجه نفس الاتجاه. بعد ذلك ، أعد شريحة المجهر إلى درجة حرارة ثابتة واسمح للخادرة بإكمال وقت النمو المناسب. في هذه الحالة ، سيكون 24 ساعة.
ستكون شريحة المجهر مع الشريط على الوجهين عبارة عن منصة تشريح عابرة لإزالة حالة العذراء. خلال ساعتين على شريحة المجهر ، ستجف حالة العذراء ، مما يجعلها قابلة للكسر بسهولة باستخدام الملقط. الخطوة الأولى في التشريح هي إزالة الخادرة من الذبيحة.
ثم سيتم نقل الخادرة إلى شريحة مختلفة مع لصق شريط على الوجهين. سيتم ترك الذبيحة وراءها. سيتم تعليق هذه الخادرة بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى ، وتوضع في منتصف الشريط.
قبل إجراء قطع الجناح ، يجب تغطية الخادرة بمحلول وفقا للإجراء باستخدام الكيمياء المناعية. سيكون هذا الحل إيجابيا وسيتم تحرير الجناح من البشرة. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأوكركولوم برفق من علبة العذراء.
اكسر العلبة بالملقط ، وقم بعمل خط على طول جانب الخادرة إلى النهاية الذيلية منها. مع الإضاءة المناسبة ، من الممكن تصور الشكل الداخلي للخادرة ، مما يجعل مساحة واضحة فوق مفصلة جناح العذراء. تعمل هذه المساحة كدليل لأداء الفتحة دون الإضرار بخادرة.
عندما يتم فتح العلبة بشكل جانبي ، سيكون من الممكن إزالة أجزاء منها ، والتقاطها من الحدود المفتوحة وحملها إلى الجانب الآخر حيث سيحملها الشريط المزدوج الجانب. في نهاية التشريح ، ستكون الخادرة عارية تقريبا. فقط قطعة من العلبة ستغطي الطرف الخلفي.
بمساعدة الملقط ، ادفع برفق ما تبقى من العلبة. ستؤدي هذه الخطوة إلى رفع الطرف الداخلي للخادرة ، مما يسمح لكل من الرأس والصدر بالبقاء في وضع تفضيلي للالتمسك بالخطوة اللاحقة. خذ شريحة جديدة بشريط على الوجهين واقلبها على خادرة.
ثم اضغط قليلا لجعل الخادرة تلتصق بالشريط وتنزلق الشريحة برفق لإزالة الخادرة من بقية الحالات. اقلب شريحة المجهر. سوف تكون الخادرة عالقة على الجانب الظهري على مستوى الرأس أو منطقة الصدر.
لاستخدام الكيمياء المناعية ، قم بتغطية الخادرة العارية بالكامل بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. بعد 10 دقائق بالإيجابية ، بمساعدة المقص ، قم بعمل شق صغير في المنطقة المفصلية للجناح أو بالقرب منه. اسمح للمثبت بالوصول إلى ظهارة الجناح.
ثم بعد خمس دقائق ، قم بتمزيق الملقط من حدود البشرة ، وتوسيع الثقب وتمكين إطلاق ظهارة الجناح من كيس البشرة. بمجرد تحرير أنسجة الجناح ، اتركه في محلول بارافورمالدهيد حتى يكتمل 30 دقيقة من التثبيت. يمكن استخدام طريقة التشريح الموضحة في هذا الفيديو لإعداد عينات عالية الجودة من ذبابة الفاكهة أجنحة العذراء من مراحل التطور المختلفة للعديد من أنواع التقنيات.
يمكن تنفيذ البروتوكول لتشريح خادرة واحدة أو عدة شرانق في نفس الوقت. هذا يساعد على تسريع الإجراء ، مما يسهل الوصول إلى عدد كبير من الأجنحة التي تم تشريحها. لإزالة الخادرة العارية من العلبة المفتوحة ، من المهم أن يكون الطرف الخلفي صغيرا بدرجة كافية.
على الرغم من أنه من الممكن إزالة صف من أربعة أو خمس خادرة عارية في نفس الوقت ، إلا أنها ليست نقطة ذات صلة ، حيث القدرة على إزالة تلك المتبقية مرتبطة بقضيتهم في خطوات متتالية باستخدام شريط واحد على الوجهين. هذه صورة متحدة البؤر لجناح APF من 24 إلى 30 ساعة. يظهر التلوين التعبير عن البروتين المرقع ، والمستقبلات الكنسية للقنفذ ، والنوى وخيوط الأكتين.
يمكن استخدام عملية تشريح مماثلة للحصول على عينات أكبر من الجناح لعزل mRNA. يمكن استخدام هذا الرنا المرسال لتصنيع (كدنا) الذي يمكن استخدامه في تفاعلات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). نعرض هنا المنتجات التي تم الحصول عليها للكشف عن التعبير عن المرقع والأكتين.
يقدم البروتوكول طريقة مباشرة للحصول على عينات من أجنحة العذراء التي تحتفظ بالتشكل المألوف للجناح. من هذه المستحضرات ، من الممكن الحصول على أكوام من الصور التي يمكن عرضها كصور ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد للتحقيق في توزيع و / أو إثراء البروتينات أثناء تمايز الجناح. يمكن استخدام بروتوكول مماثل لجمع عينة كبيرة من جناح العذراء ضرورية لتصنيع (cDNA) ، وهو جزيء ضروري في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
يوفر هذا الإجراء نهجا بديلا وتكميليا للطرق المنشورة بالفعل لتشريح جناح العذراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة خادرة ذبابة الفاكهة Drosophila، والتي تعد أساسية لمختلف التقنيات مثل الكشف المناعي ومقايسات PCR. يهدف هذا الإجراء إلى تسهيل دراسة تموضع النسخ البروتينية والبروتينات أثناء عملية النمو.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا النمو
- علم الوراثة
خلفية علمية
- يعد فهم تموضع النسخ والبروتينات أمراً بالغ الأهمية في الدراسات التنموية.
- تُستخدم ذبابة Drosophila ككائن نموذجي للأبحاث الجينية والتنموية.
- يعد التحضير الفعال للعينات ضرورياً للحصول على نتائج تجريبية دقيقة.
- يعتبر الكشف المناعي وPCR من التقنيات الشائعة المستخدمة في الأبحاث البيولوجية.
الغرض من الدراسة
- لتوفير إجراء مباشر لتشريح أجنحة الخادرة.
- لتعزيز كفاءة الحصول على العينات اللازمة لتحاليل الكشف المناعي وتفاعلات PCR.
- لدعم الأبحاث المتعلقة بتحديد مواقع النسخ والبروتينات أثناء تطور Drosophila.
الطرق المستخدمة
- استخدام فرشاة رسم مبللة للتعامل مع الخادرات برفق.
- نقل الخادرات إلى شرائح مجهرية باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه.
- تحديد توقيت النقل بناءً على عمر الخادرة.
- تقليل الضرر الذي يلحق بالخادرة أثناء عملية التشريح.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة بجمع عينات سليمة من أجنحة العذراء.
- تعتبر العينات التي يتم الحصول عليها مناسبة لمختلف التطبيقات اللاحقة.
- يتميز هذا الإجراء بالسرعة ويقلل من الإجهاد الواقع على العينات.
- يسهل إجراء دراسات التحديد الدقيق للمواقع في Drosophila.
الاستنتاجات
- تعد الطريقة الموصوفة فعالة في تشريح أجنحة الخرنقة.
- وهي تدعم دراسة العمليات التنموية في Drosophila.
- ويمكن تطويع هذه التقنية لتلبية مختلف الاحتياجات التجريبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التحضير الفعال لعينات أجنحة خادرة ذبابة الفاكهة Drosophila الكشف الموثوق عن تعبير النسخ والبروتينات، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مرحلة الاكتشاف المبكر. توفر هذه الطريقة سير عمل سريع وقابل للتكرار لإنتاج مادة بيولوجية عالية الجودة مناسبة للمقاييس اللاحقة، مما يقلل التباين في الفحص المظهري وتطوير المقاييس. ومن خلال توحيد معايير تشريح الأجنحة، تستطيع الفرق البحثية تعزيز الثقة التنبؤية في تحليل المسارات وتحديد أولويات الأهداف ذات الأساس الميكانيكي القوي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الكشف الموضعي عن بروتينات مثل patched، وهو مستقبل hedgehog نموذجي، في أنسجة الجناح النامية.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال السماح بأخذ عينات متسقة عبر المراحل النمائية لتوضيح المسارات.
- القيمة التنبؤية: تسهل تقييم ارتباط الهدف وأنماط التعبير الضرورية لتحديد المركبات الواعدة وفرز مجموعة المشاريع.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج عينات سليمة من أجنحة العذراء مناسبة لفحوصات الكشف المناعي وتفاعلات PCR، مما يتيح قراءات كمية للتعبير الجيني والبروتيني.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير تحضير العينات، مما يحسن قابلية التكرار وقابلية التوسع لحملات الفرز عالية الإنتاجية.
- جاهزية المقايسة: إنتاج مواد متوافقة مع التحليلات الجزيئية اللاحقة، مما يدعم التقييم الموثوق للمركبات في عمليات الفرز المظهري.
الأبحاث التحويلية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لدراسة التخلق المورفولوجي، مع قابلية تطبيق مباشرة على نمذجة مسارات النمو.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح تصور توزيع البروتين وإثراءه أثناء التمايز، مما يعزز الثقة في الأهداف المختارة.
- المواءمة قبل السريرية: يدعم تقييم المؤشرات الحيوية من خلال التعبير القابل للكشف عن مؤشرات مثل actin و patched في ظهارة الجناح.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتطوير المقايسة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، مما يوفر تقنيةً قابلة لإعادة الاستخدام في تحضير العينات للدراسات القائمة على ذبابة Drosophila.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين الكشف عن التواصل بين خلايا العروق وتشكيل العروق المتقاطعة أثناء تطور العذراء.
- الفحص: يوفر عينات جاهزة للمقايسة ذات مورفولوجيا متسقة، مما يعزز الموثوقية في قراءات الكشف المناعي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- التحليلات: يتيح القياس الكمي لمستويات النسخ والبروتينات، مما يساعد في التحليل المقارن عبر الظروف الوراثية أو التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط الاكتشافات المبكرة بالتحقق قبل السريري من خلال آليات تطورية محفوظة يمكن ملاحظتها في تكوين مورفولوجيا الجناح.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يضع بروتوكول تشريح قياسيًا يمكن تطبيقه في مشاريع متعددة تدرس الوراثة التطورية لـ Drosophila.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في المسارات التنموية.
- القيمة التشغيلية: تعزز من إمكانية تكرار وقابلية توسيع نطاق تحضير العينات، مما يدعم أداءً متسقاً للمقايسة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو التوقف من خلال توفير بيانات موثوقة حول تعبير الهدف وتوضعه.
- التأثير على محفظة المشاريع: تمكن من اتخاذ قرارات تقدم معدلة حسب المخاطر من خلال بيانات ميكانيكية عالية الجودة مستمدة من عينات قابلة للتكرار.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة أساسية في التعامل مع ذبابة Drosophila والفحص المجهري.
- يعتمد على أدوات قياسية: فرشاة رسم مبللة، ملقط، شرائح مجهرية مع شريط لاصق مزدوج الوجه، و 4% paraformaldehyde.
- يستلزم دقة في التوقيت بناءً على عدد الساعات بعد تكوين الخادرة (APF) لمطابقة المراحل التطورية.
- قابل للتكيف عبر مراحل تطور الجناح ولكنه مُحسَّن للخادرات في المرحلة ما بين 24–30 hour APF.
- يقتصر بضرورة إجراء التشريح اليدوي بعناية لتجنب تلف الأنسجة، رغم أن المهارة تتحسن مع الممارسة.
