وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مجموعات صحية نقية من الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ومعالجتها وراثيا ونمذجة الآليات المختلفة لإصابة الخلايا العصبية في الثقافة الأولية في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصابة الخلايا العصبية. نستخدم هذا البروتوكول للتحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية للإصابات العصبية بعد تلف الدماغ الحاد والأمراض العصبية.

الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكننا نمذجة آليات مختلفة لموت الخلايا مثل السمية المثيرة والإجهاد التأكسدي وتلف الحمض النووي والحدث التنموي باستخدام نظام الاستزراع. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول إصابة الخلايا العصبية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا مع الخلايا العصبية المخيخية للفئران لدراسة نشاط الخلايا العصبية وتشكل الخلايا العصبية استجابة لعوامل النمو والأحداث الجانبية. لاستخراج دماغ فأر عمره ستة إلى سبعة أيام ، استخدم زوجا من الملقط للإمساك بالرأس ، وباستخدام مقص التشريح الدقيق ، قم بقص الجلد من الأمام باتجاه الرأس.

ادفع الجلد للخلف للكشف عن الجمجمة. بعد ذلك ، اخترق الجمجمة بطرف المقص واقطعها من الأمام والجانبي. الحرص على عدم إتلاف المخيخ ، وتسهيل التعرف على السحايا وإزالتها ، ثم استخدام الملقط لتقشير الجمجمة التي تعرض الدماغ.

باستخدام زوج من الملقط أو الملعقة ، قم بإخراج الدماغ برفق إلى محلول تشريح بارد. لعزل المخيخ ، ضع الدماغ في محلول التشريح المكمل بكبريتات المغنيسيوم واحتفظ بالمحلول والدماغ على الجليد. تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط دقيق ، ثم قم بتشريح المخيخ من الدماغ في محلول التشريح المكمل بكبريتات المغنيسيوم.

يساعد ذلك في تقشير السحايا المتبقية ويسمح للمرء بالدخول بين الطبقات لتنظيف طيات المخيخ. وجود السحايا هو ثقافة الخلايا العصبية تؤدي إلى خلايا غير صحية وموت الخلايا في نهاية المطاف. على هذا النحو ، من المهم ضمان الإزالة الكاملة للسحايا قبل الشروع في الثقافة.

بعد ذلك ، قم بتحويل المخيخ إلى جانبه البطني وتأكد من إزالة الضفيرة المشيمية. بعد ذلك ، اسحب المخيخ إلى طبق 35 ملم يحتوي على مليلتر واحد من محلول التشريح المكممل بكبريتات المغنيسيوم. قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من محلول التشريح المخزن بكبريتات المغنيسيوم.

في هذه الخطوة ، قم بجهاز الطرد المركزي لأنبوب 15 مليلتر الذي يحتوي على الأنسجة الدماغية المفرومة لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم ، وأربع درجات مئوية. بعد ذلك قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 10 ملليلتر من محلول تشريح التربسين. ثم رج الطاولة بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

أضف ملليلترين من محلول مثبط التربسين ، أحدهما إلى الأنبوب وقم بالصخور برفق لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم وأربع درجات مئوية. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف ملليلترين من محلول مثبطات التربسين الثاني قبل نقله إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

ثم قم بتقطيع الأنسجة في أنبوب 15 مليلتر حتى يصبح المحلول غامضا. دعها تستقر لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية الصافية وانقله إلى أنبوب جديد يحتوي على مليلتر واحد من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم.

أضف ملليلترين آخرين من محلول مثبط التربسين اثنين إلى قاع الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى واتركها تستقر لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضفها إلى الأنبوب الذي يحتوي على مادة طافية من الخطوة السابقة.

كرر هذه العملية حتى يتم فصل معظم الأنسجة ميكانيكيا. أضف 0.3 مل من محلول التشريح المكمل بكلوريد الكالسيوم إلى مجموعة المواد الطافية لكل مليلتر من المادة الطافية. امزج محتويات الأنبوب ثم طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 644 مرة جم في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف 10 مل من الوسائط الطازجة إلى الحبيبات واخلطها. ثم عد الخلايا الحية وقم بتخفيفها إلى تركيز 1.5 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

ضع الخلايا على ألواح بولي D-lysine المعدة مسبقا. بالنسبة لأربع ألواح بئر ، فإن اللوحة 0.5 ميلميلميزر للعينة تعطي 7.5 في 10 للخلايا الخامسة لكل بئر. بالنسبة للأطباق مقاس 35 ملم ، ضع أربعة ملليلتر من العينة ، مع إعطاء ستة أضعاف 10 للخلايا السادسة لكل طبق.

بالنسبة لزلات الغطاء ، لوحة 0.5 ملليلتر تعطي 7.5 مرات 10 للخلايا الخامسة لكل بئر. بعد 24 ساعة ، أضف AraC إلى الألواح لتقليل التلوث الدبقي. إذا كان سيتم الحفاظ على الخلايا لمدة سبعة إلى ثمانية أيام ، كرر هذا العلاج في اليوم الثالث وحافظ على المزارع في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.

بالنسبة للثقافات التي يتم الحفاظ عليها لمدة تزيد عن خمسة أيام ، قم بتغذية المزرعة بالغلوكوز كل يومين بدءا من اليوم الخامس. للحث على السمية العصبية باستخدام NMDA ، بعد سبعة أيام في المختبر ، عالج الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ب 100 ميكرومولار NMDA و 10 ميكرومولار جلايسين لمدة ساعة واحدة. ثم استبدل الوسيط بوسط مكيف من الثقافات المتوازية بدون معالجة.

ينتج عن هذا التركيز موت الخلايا بنسبة 50٪ بعد 24 ساعة من العلاج. بالنسبة لموت الخلايا الناجم عن ROS ، عالج الخلايا العصبية ببيروكسيد الهيدروجين عند 75 إلى 100 ميكرومولار لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بتبديلها إلى الوسائط المكيفة من الثقافات المتوازية.

نظرا لعدم استقرار بيروكسيد الهيدروجين ، يجب تحسين التركيز إلى مستوى يؤدي إلى موت الخلايا بنسبة تتراوح بين 50 و 70٪ بعد 24 ساعة. هذا تركيز في عادة بين 75 و 100 [ميكرومول]. للحث على موت الخلايا عن طريق تلف الحمض النووي ، عالج الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ب 10 كامبتوثيسين ميكرومولار للحث على موت الخلايا بأكثر من 50٪ في غضون 24 ساعة.

بالنسبة لموت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن انخفاض البوتاسيوم في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ، قم بتغيير الوسائط التي تحتوي على 25 ملليمولار من البوتاسيوم إلى وسط منخفض البوتاسيوم مع خمسة ملليمولار من البوتاسيوم بعد سبعة أيام في المختبر. تم نقل الخلايا العصبية مع فيروس العدسات لطلب تقديم العروض في وزارة الداخلية من ثلاثة في وقت الطلاء. ثابت وملطخ في سبعة أيام في المختبر.

التوطين المشترك لإشارة RFP MAP2 و Hoechst لإظهار الخلايا العصبية السليمة التي يتم نقلها بالكامل بواسطة فيروسات العدس. تمثل الصور المعروضة هنا تحليلات فحص الميتة الحية للخلايا العصبية المصابة بوزارة عمل مختلفة من الفيروس الغدي لقياس السمية. تسمح الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية المصابة بالفيروس الغدي التي تعبر عن LacZ في وزارة الداخلية بين 25 و 50 بأقصى قدر من الكفاءة مع الحفاظ على الحد الأدنى من السمية.

أقل من 1٪ اختلاف في بقاء الخلية مقارنة بالتحكم عند الإصابة في وزارة الداخلية هذه. توضح هذه الأرقام تلطيخ Hoechst للخلايا العصبية الحبيبية المخيخية والخلايا العصبية الحبيبية المخيخية المعالجة ب NMDA للحث على موت الخلايا. لاحظ تكوين النوى pyknotic مع علاج NMDA.

هذا مؤشر على موت الخلايا ويمكن رؤيته في حوالي 50٪ من المزرعة بعد 24 ساعة من العلاج ب 100 ميكرومولار NMDA و 10 ميكرومولار جلايسين. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعتين ونصف باستخدام ستة كرات من الماوس ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند إجراء هذه التقنية ، من المهم استخدام تقنية معقمة وأدوات جراحية مقيدة بالسلاسل كما هو مطلوب لتقليل مخاطر تلوث المزرعة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لدراسة تطور الخلايا العصبية وإصابة الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الأولية للفأر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على زراعة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ، والتلاعب بها وراثيا باستخدام الفيروسات والحث على آليات مختلفة للإصابة العصبية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي أو فحوصات بقاء الخلية للإجابة على أسئلة مثل ما إذا كان الجين المعني يعزز بقاء الخلية استجابة للسمية المثيرة أو الإجهاد التأكسدي أو تلف الحمض النووي.