وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مجموعات نقية وسليمة من الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية، وإجراء تلاعب جيني بها ونمذجة آليات مختلفة من الإصابات العصبية في المزارع الأولية خارج الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الإصابات العصبية. نحن نستخدم هذا البروتوكول للبحث في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الإصابات العصبية التي تتبع تلف الدماغ الحاد والأمراض التنكسية العصبية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في إمكانية نمذجة آليات مختلفة لموت الخلايا، مثل التسمم الاستثاري، والإجهاد التأكسدي، وتلف الحمض النووي DNA، والأحداث التطورية باستخدام نظام الزرع هذا. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الإصابة العصبية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً مع عصبونات المخيخ لدى الجرذان لدراسة النشاط العصبي والتخلق المورفولوجي استجابةً لعوامل النمو والأحداث الجانبية. لاستخراج دماغ فأر يبلغ من العمر ستة إلى سبعة أيام، استخدم ملقطاً للإمساك بالرأس، وباستخدام مقصات التشريح الدقيق، قم بقص الجلد من الجهة الأمامية باتجاه الرأس.

قم بإزاحة الجلد للكشف عن الجمجمة. بعد ذلك، اخترق الجمجمة بطرف المقص وقم بالقص في الاتجاهين الأمامي والجانبي. مع الحرص على عدم إتلاف المخيخ، وتسهيل تحديد السحايا وإزالتها، استخدم الملاقط لإزاحة عظام الجمجمة وكشف الدماغ.

باستخدام ملقط أو ملعقة مختبرية، استخرج الدماغ برفق وضعه في محلول التشريح المبرد. لعزل المخيخ، ضع الدماغ في محلول التشريح المدعم بكبريتات المغنيسيوم وحافظ على تبريد المحلول والدماغ على الثلج. وتحت مجهر التشريح، قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط دقيق، ثم افصل المخيخ عن الدماغ في محلول التشريح المدعم بكبريتات المغنيسيوم.

يساعد هذا الإجراء في تقشير ما تبقى من السحايا ويسمح بالدخول بين الطبقات لتنظيف ثنايا المخيخ. إن وجود السحايا في المزارع العصبية يؤدي إلى ظهور خلايا غير صحية وموت الخلايا في نهاية المطاف. وبناءً على ذلك، من المهم ضمان الإزالة الكاملة للسحايا قبل البدء في عملية الزرع.

بعد ذلك، اقلب المخيخ إلى جانبه البطني وتأكد من إزالة الضفيرة المشيمية. بعد ذلك، انقل المخيخ إلى طبق سعة 35 مليمتر يحتوي على 1 مليلتر من محلول التشريح المدعم بكبريتات المغنيسيوم. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مليمتر يحتوي على 30 مليلتر من محلول التشريح المنظم بكبريتات المغنيسيوم.

في هذه الخطوة، يتم وضع الأنبوب سعة 15 milliliter الذي يحتوي على نسيج الدماغ المقطع في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 644 ×g، ودرجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم إزالة السائل الطافي، وإضافة 10 milliliters من محلول التريبسين للتشريح. ثم يتم رج الأنبوب باستخدام الهزاز عالي السرعة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C.

أضف 2 mL من محلول مثبط التربسين الأول إلى الأنبوب ورجّه بلطف لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 644 ×g ودرجة حرارة 4 °C. بعد مرور خمس دقائق، تخلص من السائل الطافي، وأضف 2 mL من محلول مثبطات التربسين الثاني قبل نقل المحتوى إلى أنبوب سعة 15 mL.

ثم قم بسحق الأنسجة في أنبوب سعة 15 ملليلتر حتى يصبح المحلول عكرًا. اترك المحلول ليترسب لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الرائق الشفاف وانقله إلى أنبوب جديد يحتوي على ملليلتر واحد من محلول التشريح المدعم بكلوريد الكالسيوم.

أضف 2 mL أخرى من محلول مثبط التريبسين 2 إلى قاع الأنبوب الذي يحتوي على الراسب. قم بتجنيسه مرة أخرى واتركه يترسب لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السائل الطافي وأضفه إلى الأنبوب الذي يحتوي على السائل الطافي من الخطوة السابقة.

كرر هذه العملية حتى يتم تفكيك معظم النسيج ميكانيكياً. أضف 0.3 milliliters من محلول التشريح المضاف إليه كلوريد الكالسيوم إلى المجموعة المجمعة من السائل الطافي لكل milliliter من السائل الطافي. اخلط محتويات الأنبوب ثم قم بطردها مركزياً لمدة خمس دقائق عند 644 times G في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي. أضف 10 milliliters من الوسط الغذائي الطازج إلى الراسب واخلطهما. ثم قم بعد الخلايا الحية وتخفيفها لتصل إلى تركيز 1.5 × 10⁶ خلية لكل milliliter.

قم بتوزيع الخلايا على أطباق poly D-lysine التي تم تحضيرها مسبقاً. بالنسبة للأطباق ذات الآبار الأربعة، يتم توزيع 0.5 millimiters من العينة، مما يعطي 7.5 times 10 to the fifth خلية لكل بئر. وبالنسبة للأطباق ذات قطر 35 millimeter، يتم توزيع أربعة milliliters من العينة، مما يعطي six times 10 to the sixth خلية لكل طبق.

بالنسبة للشرائح الغطائية، يتم وضع 0.5 ملليلتر بما يعادل 7.5 × 10⁵ خلية لكل بئر. وبعد مرور 24 ساعة، يُضاف AraC إلى الأطباق لتقليل التلوث الدبقي. وإذا كان سيتم الحفاظ على الخلايا لمدة تتراوح من سبعة إلى ثمانية أيام، تُكرر هذه المعالجة في اليوم الثالث، وتُحفظ المزارع في حاضنة تحتوي على 5%CO2 عند درجة حرارة 37 °C.

بالنسبة للمستنبتات التي يتم الحفاظ عليها لأكثر من خمسة أيام، يتم تزويد المستنبت بالجلوكوز كل يومين بدءاً من اليوم الخامس. ولتحفيز السُمِّيّة الاستثارية العصبية باستخدام NMDA، وبعد مرور سبعة أيام في المختبر، تُعالج الخلايا الحبيبية في المخيخ بـ 100 micromolar من NMDA و 10 micromolar من الجلايسين لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، يتم استبدال الوسط بوسط مُكيَّف من مستنبتات موازية لم تخضع لأي علاج.

يؤدي هذا التركيز إلى موت 50% من الخلايا بعد 24 ساعة من المعالجة. لتحفيز موت الخلايا الناتج عن أنواع الأكسجين التفاعلية ROS، تُعالج العصبونات ببيروكسيد الهيدروجين بتركيز من 75 إلى 100 micromolar لمدة خمس دقائق. وبعد مرور خمس دقائق، يتم استبدال المحلول بالوسط المكيف من مزارع موازية.

نظراً لعدم استقرار بيروكسيد الهيدروجين، يجب تحسين التركيز للوصول إلى مستوى يحفز موت الخلايا بنسبة تتراوح بين 50 و 70% بعد مرور 24 ساعة. وعادة ما يكون هذا التركيز بين 75 و 100 micromolar. ولتحفيز موت الخلايا عن طريق تلف الحمض النووي DNA، تُعالج عصبونات الحبيبات المخيخية بـ 10 micromolar من مادة camptothecin لتحفيز موت الخلايا بنسبة تزيد عن 50% خلال 24 ساعة.

لإحداث الموت الخلوي المبرمج العصبي الناتج عن نقص البوتاسيوم في عصبونات الحبيبات المخيخية، يتم استبدال الوسط الذي يحتوي على 25 millimolar من البوتاسيوم بوسط منخفض البوتاسيوم يحتوي على خمسة millimolar من البوتاسيوم بعد سبعة أيام من الزرع خارج الجسم الحي. تم نقل RFP إلى العصبونات باستخدام الفيروس lentivirus بمعدل إصابة (MOI) قدره ثلاثة عند وقت الزرع. تم التثبيت والصبغ بعد سبعة أيام من الزرع خارج الجسم الحي.

يظهر التوضع المشترك لإشارة RFP و MAP2 و Hoechst لإثبات وجود عصبونات سليمة تم نقل الجينات إليها بالكامل بواسطة الفيروسات البطيئة. وتمثل الصور المعروضة هنا تحليلات مقايسة الخلايا الحية والميتة للعصبونات المصابة بمضاعفات عدوى (MOI) مختلفة من الفيروسات الغدية لقياس السمية. تسمح إصابة عصبونات الحبيبات المخيخية بالفيروسات الغدية التي تعبر عن LacZ بمضاعفة عدوى (MOI) تتراوح بين 25 و 50 بتحقيق أقصى قدر من الكفاءة مع الحفاظ على أدنى مستوى من السمية.

يُلاحظ وجود فرق يقل عن 1% في بقاء الخلايا مقارنة بالمجموعة الضابطة عند العدوى بهذا الـ MOI. وتوضح هذه الأشكال صبغ Hoechst للعصبونات الحبيبية المخيخية الضابطة والعصبونات الحبيبية المخيخية المعالجة بـ NMDA لتحفيز موت الخلايا. لاحظ تكون النوى التكثفية مع المعالجة بـ NMDA.

يعد هذا مؤشراً على موت الخلايا، ويمكن ملاحظته في ما يقرب من 50% من المزرعة بعد 24 ساعة من المعالجة بـ 100 micromolar من NMDA و 10 micromolar من glycine. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين ونصف باستخدام ست عينات من أدمغة الفئران، في حال تنفيذها بشكل صحيح. وعند تطبيق هذه التقنية، من المهم استخدام أساليب التعقيم والأدوات الجراحية المعقمة حسب الاقتضاء، وذلك لتقليل مخاطر تلوث المزرعة.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لدراسة التطور العصبي والإصابة العصبية في الخلايا العصبية الأولية للفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على زراعة الخلايا العصبية الحبيبية في المخيخ، والتلاعب الجيني بها باستخدام الفيروسات، وتحفيز آليات مختلفة من الإصابة العصبية. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التألق المناعي أو اختبارات حيوية الخلايا للإجابة على تساؤلات مثل ما إذا كان جين معين يعزز بقاء الخلية استجابةً للسمية الاستثارية، أو الإجهاد التأكسدي، أو تلف الحمض النووي DNA.