رباعية المناعية من لمبة الشمية لتصور رموز حسية أكسون الجزيئية الحسية

الهدف العام من طريقة التلوين الكيميائي النسيجي المناعي هذه هو تصور التعبير المشترك لجزيئات فرز المحاور العصبية عند النهايات المحورية للعصبونات الحسية الشمية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في توصيف العمليات الرئيسية في مجال التطور الشمي، مثل توجيه المحاور العصبية، وتكوين المشابك، وتجدد العصبونات الحسية الشمية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح للعلماء بمقارنة وتحليل أنماط تعبير جزيئات فرز المحاور العصبية في البصلة الشمية دون حدوث تباين بين المقاطع النسيجية.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوة الطمر، حيث يصعب وصف وضعية وزاوية عينة الأنسجة الشمية في القالب بالكلمات. ابدأ باستخدام رؤوس فئران يتراوح عمرها من أسبوع إلى أسبوعين، والتي تم تثبيتها عن طريق التروية القلبية بـ 4%paraformaldehyde. أدخل شفرة مقص في المساحة الموجودة بين الأسنان العلوية والسفلية، وقم بالقص أفقياً لإزالة عظم الفك السفلي.

بعد ذلك، قم بإزالة الأنسجة الزائدة باستخدام الملقط والمقص، لترك الأنسجة الشمية، بما في ذلك البصلة الشمية والظهارة الشمية. اغمر الأنسجة الشمية في PBS لإزالة الهواء من التجويف الأنفي، ثم قم بإجراء قطع عمودي لإزالة الجزء الخلفي من الدماغ، وضع الأنسجة الشمية في قاع قالب التضمين بحيث يكون الطرف المقطوع متجهاً للأسفل. املأ القالب بمركب درجة حرارة القطع المثالية (OCT)، ثم اغمره في النيتروجين السائل.

بعد تجميد النسيج ومركب OCT تماماً، يتم موازنة درجة حرارة النسيج في جهاز الميكروتوم المبرد (cryostat) عند 20 درجة celsius لمدة ساعة واحدة. الآن، يتم عمل قطاعات متسلسلة موازية للسهمين (parasaggital) للبصلة الشمية باستخدام جهاز الميكروتوم المبرد، وتُجمع هذه القطاعات عن طريق لصقها على شرائح زجاجية مغطاة بـ MAS. بعد اللصق، تُجفف الشرائح فوراً باستخدام مجفف الشعر.

ابدأ عملية التصبيغ المناعي بغسل الشرائح المجففة بمحلول PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بحجب مواقع الارتباط غير النوعية عن طريق تحضين الشرائح لمدة ساعة واحدة مع محلول حجب بتركيز 5% في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 400 microliters من مزيج من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول حجب بتركيز 1% إلى كل شريحة.

يتم تحضين الشرائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، يتم التخلص من محلول الأجسام المضادة الأولية وغسل الشرائح باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم إضافة 400 µL من مزيج من الأجسام المضادة الثانوية وPBS إلى كل شريحة.

يُحمى من الضوء ويُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم التخلص من المحلول وغسل الشرائح مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، يتم تثبيت أغطية الشرائح بوضع قطرتين من وسط التثبيت على كل شريحة، ثم وضع غطاء الشريحة، وإزالة الفقاعات الهوائية.

التقط صوراً فلورية باستخدام المجهر الفلوري مستعيناً بالمرشح المناسب لكل فلوروفور. اضبط وقت التعرض للحصول على إشارات فلورية في الصورة دون حدوث تشبع. حدد بنية الكبيبة من خلال إشارات التألق المناعي لـ GLUT2.

استخدم برنامج Image J لقياس شدة صبغة جزيئات فرز المحاور العصبية داخل الكبيبات. تُظهر هذه الصورة مقطعاً جنيبياً من البصلة الشمية لفأر يبلغ من العمر أسبوعين، مصبوغاً مناعياً بأجسام مضادة ضد VGLUT2، وKirrel2 الموضح باللون الأحمر، وSemaphorin 7A الموضح باللون الأخضر، وOLPC باللون الأزرق. وتوضح الصورة المدمجة أن جزيئات فرز المحاور العصبية المشاركة في الفصل الكبيبي يتم التعبير عنها وفق نمط فسيفسائي مستقل عن الموضع.

يتم تحديد كل كبيبة عن طريق الإشارات الفلورية للمؤشر قبل التشابكي VGLUT2. وتحاط الهياكل الكبيبية بخطوط متقطعة. كما تم قياس شدة إشارات جزيئات فرز المحاور في كل كبيبة.

كما يتضح هنا، يتم التعبير عن جزيئات فرز المحاوير بشكل متفاوت في كل كبيبة شمية. فعلى سبيل المثال، تحتوي الكبيبة 3 على مستويات عالية من OLPC، ومستويات متوسطة من Semaphorin 7A، ومستويات منخفضة من Kirrel2، ويمكن قياس هذا الاختلاف كمياً عن طريق قياس كثافة الصبغ. بينما تحتوي الكبيبة 4 على مستويات عالية من OLPC، ومستويات منخفضة من Kirrel2 وSemaphorin 7A.

ومرة أخرى، يمكن قياس هذا الفرق كمياً من خلال قياس كثافة التلوين. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر حذف خطوة التثبيت اللاحق باستخدام PFA، والمعالجة بمحلول السكروز، واللذين يُنصح بهما عادةً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وضع المزيد من الكبيبات في مقطع واحد من البصلة الشمية، وكيفية إجراء تلوين مناعي عالي الجودة باستخدام أجسام مضادة متعددة، وهو ما يمكن تطبيقه على مناطق أخرى من الدماغ.

لا تنسَ التمسك بالأمل، فهذه الطريقة ستساعدك على النجاح في تجاربك المستقبلية.