Name: الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: تعلم تقنية الفلورة الكمية لتصور الترجمة الموضعية في خلايا MRC-5 أثناء الالتصاق الخلوي باستخدام البيوروميسين والمجهر المكافئ. هذه الطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر الدكتور رشيد المزروعي (جامعة لافال، كيبيك، كندا) لقراءة نقدية من المخطوطة. ونحن نشكر "وحدة التصوير الخلية" التابعة لمركز البحوث الخاصة بالمساعدة التقنية. هوت م. É. هو أحد علماء البحوث 1 جونيور دي فوندز بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S). هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح عدد استوفوا، 286437 اجتماع الأطراف أن É م. هوت).

<ol><li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li>
<li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li>
<li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRICK%3A+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li>
<li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li>
<li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population%3A+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192(2016).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li>
<li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells%2C+necessary+for+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET%3A+a+valid+alternative+to+traditional+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Sport+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li>
<li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li>
<li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+cells+move+messages%3A+the+biological+functions+of+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li>
<li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+the+bicoid+morphogen+gradient+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li>
<li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analysis+of+mRNA%2C+Translation%2C+and+Protein+Localization%3A+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li>
<li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968(2012).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وأتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة لفهم أفضل لآليات المشاركة في upregulation متعدية الجنسيات أو قمع مرناس محددة في العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث. منهجية فعالة من حيث التكلفة الموضحة هنا يسمح لترجمة الأحداث تصور في الخلايا لدراسة كيف البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة تنظم عمليات المنتشر، مثل التصاق الخلوية، والهجرة، والغزو.
على الرغم من أن قد وضعت أساليب عديدة لتقييم الترجمة البروتين حيثياته ، أنهم جميعا مشاركة نفس الاستراتيجية، التي تت...

تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف1،2 ،،من34. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث5 6، ،،من78. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)5. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل5. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف9. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم10. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً9،11،12 .
باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية5. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.
ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية6،،من1314، 15ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية5، 7 , 18-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin الأجسام المضادة 12D10</td><td>EMD millipore</td><td>MABE343</td><td>تخفيف اللطخة الغربية 1: 25،000 تخفيف التألق المناعي 1: 10،000</td></tr><tr><td>IgG المضاد للفأر ، إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP</td><td> التكنولوجيا</td><td>7076</td> تخفيف <td>اللطخة الغربية 1: 8,000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>IgG المضاد للفأر (H + L) ، F (ab') 2 جزء (Alexa Fluor 488 Contringate)</td> تقنية <td>إشارات الخلية</td><td>4408</td> تخفيف <td>الفلور المناعي 1: 400</td></tr><tr><td>CF568 الفالودين</td><td>البيوتيوم</td><td>00044</td> تخفيف <td>الفلور المناعي 1: 400</td></tr><tr><td>Cyclohexmide</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50 & micro; جم / مل التركيز النهائي</td></tr><tr><td>DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dihydrochloride)</td> <td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>التركيز النهائي 1 & micro ؛ جم / مل</td></tr><tr><td>بوروميسين</td><td>بيو بيسك</td><td>PJ593</td><td>2.5 ومايكرو ؛ جم / مل إلى 10 & مايكرو ؛ جم / مل</td></tr><tr><td>Ibidi & micro ؛ - طبق 35 مم ، مرتفع ، ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 خلايا</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>خلايا HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 خلايا</td><td>من Dr. Mazroui (Universit & eacute; لافال)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>نظام التصوير متحد البؤر</td> <td>Fv1000</td><td>أوليمبوس</td><td></td></tr><tr><td>برنامج فيجي</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (فوسفات بافأحمر سالين) بيو</td> <td>بيسك</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>الفورمالديهايد 37٪ محلول</td><td>حيوي أساسي</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>تريتون X-100</td><td>بيو بياسيك</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>كواشف فيشر الحيوية</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>فيشر الكواشف الحيوية</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الآليات التي تنظم الترجمة مرناً وتشارك في مختلف العمليات البيولوجية، مثل جرثومة خط التنمية وتمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس، وكذلك في العديد من الأمراض. وقد أظهرت العديد من المنشورات مقنع أن آليات محددة تنظم أحكام الترجمة مرناً. زيادة الاهتمام بتنظيم تعبير البروتينات المستحثة بالترجمة أدى إلى استحداث طرق جديدة لدراسة ومتابعة حيثياته البروتين التوليف في سيلولو. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب معقدة ويجعلها مكلفة وكثيراً ما يحد من عدد أهداف مرناً التي يمكن دراستها. وتقترح هذه المخطوطة أسلوب الذي يتطلب فقط الكواشف الأساسية ونظام تصوير الأسفار [كنفوكل] قياس ووضع تصور للتغيرات التي تحدث في أي خط الخلية تحت ظروف مختلفة في الترجمة مرناً. واستخدمت هذا الأسلوب مؤخرا لإظهار الترجمة المترجمة في الهياكل سوبسيلولار الخلايا ملتصقة على مدى فترة قصيرة من الوقت، مما يتيح إمكانية تصور الترجمة حيثياته لفترة قصيرة من خلال مجموعة متنوعة من البيولوجية العمليات أو التحقق من صحة التغييرات في النشاط متعدية الجنسيات في الاستجابة للمحفزات محددة.

لدقة مراقبة أحداث الترجمة باستخدام إدراج بوروميسين، من الأهمية بمكان لتحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية لأنه يظهر كل بوروميسين مختلفة إدماج حركية (الشكل 1)9،11 ،،من1218. ومن ثم، للتحقق من صحة إدراج بوروميسين، من الضروري التعامل مع خط الخلية المطلوب مع مجموعة موحدة من التركيزات المتزايدة بوروميسين (1.0 و 2.5، 5.0، 7.5، 10.0 و 15.0 م...

هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور وقياس أحداث الترجمة المقسمة التي تحدث خلال الخطوات الأولية لالتصاق الخلايا. تمتلك هذه الطريقة تطبيقاً واسعاً؛ لذا استخدمها كلما دعت الحاجة إلى تحليل استجابة ترجمة محددة وسريعة، كما هو الحال عند تحليل هجرة الخلايا، أو التصاقها، أو الاستجابة المبكرة للعقاقير.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. فهي لا تتطلب سوى البوروميسين (puromycin)، والأجسام المضادة الموجهة ضد البوروميسين، ونظام تصوير المسح البؤري القياسي. للبدء، قم بتحضير معلق من خلايا MRC-5.استخدم عملية التريبسين (Trypsinization)، متبوعة بالطرد المركزي، ثم إزالة السائل الطافي، وبعد ذلك إعادة التعليق في وسط DMEM مع 10% من مصل الجنين البقري (FBS)، بتركيز 40 thousand cells per milliliter. قم بتحضين المعلق مع تدوير لطيف لمدة 20 دقيقة لتفكيك معقدات الالتصاق البؤري بالكامل. هذه الخطوة بالغة الأهمية.بعد ذلك، أضف حصصاً قدرها 2 مل من المعلق إلى طبقين زجاجيين بقاعدة مسطحة مقاس 35 مليمتر، واحضنهما للسماح بالالتصاق الخلوي وتكوين SiC. بعد مرور 40 دقيقة، عالج أحد الأطباق باستخدام cycloheximide، وأعده إلى المحضنة. سيعمل هذا الطبق كضابط سلبي.بعد مرور 55 دقيقة، أضف puromycin إلى كلا الطبقين بالتركيز المحدد مسبقاً، ثم حضن الطبقين لمدة خمس دقائق إضافية. وبعد ساعة واحدة من الاستزراع وخمس دقائق من التعرض لـ puromycin بالتزامن، اغسل كل طبق مرتين باستخدام 2 mL من PBS المبرد بالثلج. بعد ذلك، قم بتثبيت الخلايا باستخدام 1 mL من formaldehyde بتركيز 4% في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم قم بنفاذية الخلايا باستخدام 500 microliters من triton X-100 بتركيز 0.5 percent في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم ضع 500 microliters من BSA بتركيز one percent في PBS. استمر في الحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة إضافية.لإزالة BSA الزائد، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام Tween-20 بتركيز 0.1% في PBS. الآن، قم بتحضين الخلايا مع 300 µL من الجسم المضاد anti-puromycin. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة باستخدام ثلاث غسلات بـ Tween-20 بتركيز 0.1%.بعد ذلك، يتم وضع 300 µL من مزيج من جسمين مضادين ثانويين مقترنين بفلوروفور لتصوير الببتيدات المتعددة والمؤشرة بالبورومايسين (puromycolated polypeptides) وde factem. تُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وبعد مرور ساعة، تُغسل الأطباق ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة، ثم يُوضع 300 µL من محلول Tween-20 بتركيز 0.1%، مضافاً إليه DAPI.اترك صبغة DAPI في الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، اغسل الخلايا أربع مرات إضافية، على أن تكون الغسلة الأخيرة باستخدام PBS نقي. ثم، احفظ الخلايا في 2 mL من PBS لإجراء التصوير.باستخدام أي نظام تصوير بؤري (confocal) متاح تجاريًا، حدد أولاً الإعدادات المناسبة التي ترفع المدى الديناميكي إلى أقصى حد من أجل التكميم. لا يمكن الحصول على تركيز دقيق للتكميم إلا إذا تم تجنب تشبع حجم الذروة وضبط التركيز بشكل صحيح. ويمكن الوصول إلى هذه الإعدادات من خلال الضبط الدقيق لقوة الليزر والتعويضات (offsets).أولاً، قم بضبط عامل التكبير وعدد البكسلات لتحسين حجم البكسل. افعل ذلك وفقاً لنظرية نايكويست (Nyquist theorem). بعد ذلك، قم بتقليل سرعة المسح واستخدم تقنية المتوسط الحسابي لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.بعد ذلك، حدد يدويًا المستويات البؤرية العلوية والسفلية المناسبة على طول المحور Z، واضبط حجم الخطوة StepSize عن طريق حساب الدقة المحورية وقسمة هذه المسافة على 2.3. والنتيجة النموذجية هي من 20 إلى 25 طبقة من الصور. وبمجرد ضبط الإعدادات، التقط صورة كونفوكالية لخلية واحدة كاملة باستخدام عدسة شيئية زيتية 60x Plan Apo بفتحة عددية 1.42.لقياس وتحليل إشارات الفلوروفور، افتح أولاً الصورة المقابلة لطبقة المستوى z المطلوب في برنامج image J. ثم باستخدام أداة الرسم، ارسم خطاً عبر الخلية المراد قياسها. بعد ذلك، قم بتعديل عرض الخط عن طريق النقر المزدوج على straight. سيتم حساب متوسط قيم الكثافة عبر عرض الخط، لذا استخدم خطاً أرق لتجنب تداخل الإشارات من هياكل مختلفة.بعد ذلك، قم بتحديد مظهر كثافة الإشارة على طول الخط. والآن، كرر عملية جمع كثافة الإشارة على طول الخط نفسه في القناة التي تتوافق مع الفلوروفور. ستكون القيم دائمًا مرتبة وفقًا لاتجاه الخط.الآن، قم بنسخ بيانات المقطع العرضي ولصقها في جدول بيانات لإجراء التحليل. كرر عملية جمع البيانات هذه من كل صورة في المستوى Z المطلوبة قبل البدء في التحليل الإحصائي. بدلاً من ذلك، يمكن جمع الإشارة من منطقة في الصورة بدلاً من جمعها على طول محور معين.استخدم أولاً وظيفة الشكل الهندسي لتحديد المنطقة ذات الأهمية. بعد ذلك، اضبط مستوى العتبة لتجنب أي خلفية. في المخطط التكراري لكثافة البكسل، حرك الشريط المنزلق لضبط البكسلات التي سيتم تضمينها في عملية القياس الكمي.اضبط العتبة لاستبعاد جميع البكسلات الحمراء الموجودة خارج الخلية. الآن، حدد معاملات القياس اللازمة لقياس الإشارة المطلوبة وليس إشارة الخلفية. قم بتفعيل خياري تحديد العتبة والكثافة المتكاملة.بعد ذلك، استخدم أمر القياس (measure). سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة تحتوي على متوسط القيم الرمادية وعدد البكسلات في المنطقة المحددة. الآن كرر هذه العملية، مع تطبيق عتبة التحديد نفسها لتعيين شدة الإشارة في الخلية بأكملها.ثم استخدم هذه البيانات لحساب نسبة الإشارة في المنطقة المحددة إلى إشارة الخلية بأكملها. ومن أجل القياس الدقيق لأحداث الترجمة باستخدام دمج purmycin، تم أولاً تقييم الظروف المثلى للقياس المحوري. حيث تمت مقارنة مجموعة من التركيزات مقابل فترة معالجة مدتها خمس أو عشر دقائق.كان تركيز البيوروميسين المقبول لخلايا MRC-5 وHeLa أعلى قليلاً من التركيز المطلوب لخلايا Huh-7. وأدت معالجة الخلايا لمدة عشر دقائق بتركيزات عالية من البيوروميسين إلى تكوين بولي ببتيدات مُبِيوروميسينmostly أصغر حجماً. وتنتشر هذه البولي ببتيدات الأصغر بسرعة أكبر، وهي غير مرغوب فيها.وبناءً على ذلك، اعتبرت فترة الحضانة الأقصر أكثر ملاءمة. ويُعد العلاج بـ Cycloheximide ضابطاً سلبياً فعالاً وهاماً. وفي خلايا MRC-5، تم اكتشاف إشارة puromycin ضعيفة فقط بعد العلاج بـ cycloheximide.باستخدام التكميم المحوري للإشارة، يمكن تقييم التموضع العام للعديد الببتيدات المرتبطة بالبورومايسين والتي تقابل البروتينات حديثة التخليق عند مستويات مختلفة داخل الخلية. كما كان من الممكن إجراء توزيع كمي للإشارة في جميع أنحاء الخلية. وبالنسبة لكلتا التقنيتين، كان من المهم تكميم الإشارة لكل مستوى Z في مجموعة الصور لتقييم أحداث الترجمة بدقة في الخلية بأكملها.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تقييم حدث الترجمة في الحجيرات تحت الخلوية. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون يوم واحد، إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وعند التفكير في هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تركيز puromycin ووقت تحضينه أمران بالغي الأهمية.للحد من الانتشار، يفضل تقليل وقت الحضن. ومن المهم أيضاً إدراك أن جودة نوع الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج جيدة. لا تنسَ أن العمل مع الفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل غطاء كيميائي عند تنفيذ هذا الإجراء.

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة بروتين الخلية المصابة 0 ، ICP0 الاتجار بفيروس الهربس البسيط -1. بعد التوليف من جديد ، ينتقل ICP0 إلى النواة ، ثم ينتقل لاحقا إلى السيتوبلازم أثناء تطور العدوى. يكشف المجهر المناعي عن توطين البروتين تحت الخلوي ويحلل ، ويقدم رؤى حول الاتجار به عبر مراحل العدوى.

تقنية التألق المناعي لتوطين البروتين الفيروسي في الخلايا المصابة

نحن هنا وصف طريقة لتصور الشبكة الهيولية الباطنة المرتبطة mRNAs والثدييات في خلايا الأنسجة. هذا الأسلوب الذي ينطوي على permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما مع ديجيتونين لإزالة محتويات حشوية تليها...

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

هنا ، تم تطوير اختبار مضان كمي جديد لقياس التغيرات في مستوى البروتين على وجه التحديد في الجسيمات المركزية عن طريق تطبيع شدة مضان هذا البروتين إلى معيار داخلي مناسب.

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

&lt; p class = 'jove_content'&gt; أنواع الخلايا الملتصقة الرئيسية المشتقة من العضلات البشرية هي الخلايا العضلية والخلايا الليفية. هنا ، يتم إثراء مجموعات الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا بناء على مستضد CD56. يسمح وضع العلامات المناعية اللاحقة بأجسام مضادة محددة واستخدام تقنيات تحليل الصور بالقياس الكمي للخصائص السيتوبلازمية والنووية في الخلايا الفردية.

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

توطين سكان غولجي دقيقة أمر ضروري لفهم وظائف غولجي الخلوي. المجهر الضوئي التقليدية غير قادر على تحليل هيكل sub-غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول لأسلوب الفحص المجهري التقليدي على أساس قرار فائقة لتحديد الكمية الترجمة sub-غولجي بروتين.

تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار

يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج للتحقق من صحة الأنسجة الفلورة مقترنة بتحليل الصورة كوسيلة لتحديد كمية وتين فائدة في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين. نتائجنا تثبت فائدة علم الأنسجة الفلورة للتحقق من الكمية النسبية للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية.

إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية

هنا، يمكننا وصف نهج كمي لتحديد توزيع البروتين متشابك بالنسبة للبروتين علامة استخدام الفلورة تلطيخ والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب.

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

نحن نصف بروتوكول باستخدام الفلورة في الموقع التهجين (FISH) لتصور RNAs الهربس الفيروسي متعددة داخل الخلايا البشرية المصابة lytically، إما في تعليق أو التمسك. يتضمن هذا البروتوكول تحديد كمية الفلورة التي تنتج نسبة النيوكليوسيتوبلازمية ويمكن تمديدها للتصور المتزامن للبروتينات المضيفة والفيروسية ذات الفلورة المناعية (IF).

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

يتيح تتبع أحداث الترجمة الفردية إجراء دراسات حركية عالية الدقة لآليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى. هنا نظهر في المختبر اختبار جزيء واحد على أساس التفاعلات التصوير بين الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت والببتيدات الناشئة الموسومة epitope. تمكن هذه الطريقة من توصيف جزيء واحد للبدء وحركية استطالة الببتيد أثناء الترجمة النشطة في المختبر المعتمدة على الغطاء.

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

تعلم تقنية الفلورة الكمية لتصور الترجمة الموضعية في خلايا MRC-5 أثناء الالتصاق الخلوي باستخدام البيوروميسين والمجهر المكافئ. هذه الطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

استكشف المزيد من الفيديوهات