الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور وقياس أحداث الترجمة المجزأة التي تحدث خلال الخطوات الأولية للتصاق الخلية. هذه الطريقة لها تطبيق واسع. استخدمه كلما كانت استجابة الترجمة المحددة السريعة فحصا كما هو الحال عند تحليل هجرة الخلايا أو الالتصاق أو الاستجابة المبكرة للأدوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. لا يتطلب سوى البيرومايسين والأجسام المضادة الموجهة ضد البيرومايسين ونظام التصوير القياسي بالمسح متحد البؤر. للبدء ، قم بعمل تعليق لخلايا MRC-5.

استخدم التربسين ، متبوعا بالطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، ثم إعادة التعليق في DMEM بنسبة عشرة بالمائة FBS ، بنسبة 40 ألف خلية لكل مليلتر. احتضن التعليق مع دوران لطيف لمدة 20 دقيقة لفصل مجمعات الالتصاق البؤري تماما. هذا أمر بالغ الأهمية.

بعد ذلك ، في طبقين من القاع الزجاجي مقاس 35 ملم ، أضف معلقين من المليلتر ، واحتضنهما للسماح بالالتصاق الخلوي وتكوين كربيد الكركر. بعد 40 دقيقة ، عالج طبقا واحدا بالسيكلوهيكسيميد ، وأعده إلى الحاضنة. ستعمل هذه اللوحة كعنصر تحكم سلبي.

بعد 55 دقيقة ، ضع بورومايسين على كلا الطبقين بتركيز محدد مسبقا ، واحتضن الأطباق لمدة خمس دقائق أخرى. بعد ساعة واحدة من البذر وخمس دقائق من بورومايسين بالتعاون ، اغسل كل طبق مرتين بملليلترين من PBS المثلج. ثم قم بإصلاح الخلايا بمليلتر واحد من الفورمالديهايد بنسبة أربعة بالمائة في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التثبيت ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم تخلل الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من 0.5 في المائة تريتون X-100 في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الألواح ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم ضع 500 ميكرولتر من واحد بالمائة BSA في PBS. استمر في حضانة درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة أخرى.

لإزالة BSA الزائد ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.1 في المائة Tween-20 في PBS. الآن ، احتضان الخلايا ب 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة للبورومايسين. قم بإزالة الجسم المضاد غير المرتبط باستخدام ثلاث غسلات بنسبة 0.1 بالمائة من Tween-20.

بعد ذلك ، ضع ثلاثمائة ميكرولتر من خليط من اثنين من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور لتصور عديد الببتيدات النقية والواقع. احتضان الخلايا لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ساعة ، اغسل الألواح ثلاث مرات لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ثم ضع ثلاثمائة ميكرولتر من محلول Tween-20 بنسبة 0.1 في المائة ، مع استكمال DAPI.

اسمح ل DAPI بالبقاء في الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اغسل الخلايا أربع مرات أخرى ، وانتهي بغسل في PBS نقي. ثم قم بتخزين الخلايا في ملليلترين من PBS للتصوير.

باستخدام أي نظام تصوير متحد البؤر متاح تجاريا ، حدد أولا الإعدادات المناسبة التي تزيد من النطاق الديناميكي للقياس الكمي. لا يمكن الحصول على التركيز على القياس الكمي إلا إذا تم تجنب تشبع حجم الذروة وتم ضبط التركيز بشكل صحيح. يمكن تحقيق الإعداد عن طريق ضبط ميزة طاقة الليزر والإزاحة بعناية.

أولا ، اضبط عامل التكبير وعدد وحدات البكسل لتحسين حجم البكسل. افعل ذلك وفقا لنظرية Nyquist. بعد ذلك ، قم بتقليل سرعة المسح واستخدم المتوسط لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.

بعد ذلك ، حدد يدويا المستويات البؤرية العلوية والسفلية المناسبة على طول المحور Z ، واضبط StepSize عن طريق حساب الدقة المحورية وقسمة هذه المسافة على 2.3. والنتيجة النموذجية هي 20 إلى 25 طبقة صورة. بمجرد تعديل الإعدادات ، احصل على صورة متحدة البؤر لخلية واحدة كاملة باستخدام هدف غمر الزيت 60x Plan Apo بفتحة عددية 1.42.

لتحديد وتحليل إشارات فلوروفور ، افتح أولا صورة تتوافق مع طبقة المستوى z ذات الأهمية في الصورة J.ثم ، باستخدام أداة الرسم ، قم بعمل خط عبر الخلية حيث يكون القياس الكمي مطلوبا. بعد ذلك ، قم بتعديل نفحة الخط بالنقر المزدوج على المستقيم. سيتم حساب متوسط قيم الشدة من خلال عرض الخط ، لذا استخدم خطا أرق لتجنب تداخل الإشارة من الهياكل المختلفة.

ثم قم بتحديد كثافة الإشارة على طول الخط. الآن ، كرر عملية تجميع كثافة الإشارة على طول نفس الخط في القناة التي تتوافق مع الفلوروفور. سيتم ترتيب القيم دائما باستخدام اتجاه الخط.

الآن ، انسخ بيانات الملف الشخصي والصقها في جدول بيانات لتحليلها. كرر هذه العملية لجمع البيانات من كل صورة مستوى Z ذات أهمية قبل متابعة التحليل الإحصائي. بدلا من ذلك ، بدلا من جمع الإشارة على طول المحور ، يمكن جمع الإشارة من منطقة من الصورة.

أولا ، استخدم دالة النموذج الهندسي لتحديد منطقة الاهتمام. بعد ذلك ، اضبط مستوى العتبة لتجنب أي خلفية. في الرسم البياني لشدة البكسل ، حرك شريط التمرير لضبط وحدات البكسل التي سيتم تضمينها في القياس الكمي.

قم بتعيين الحد لإزالة جميع وحدات البكسل الحمراء خارج الخلية. الآن ، حدد معلمات القياس اللازمة لقياس إشارة الاهتمام وليس إشارة الخلفية. قم بتبديل الحد إلى خيارات الحد والكثافة المتكاملة.

بعد ذلك ، استخدم الأمر measure. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة بمتوسط القيم الرمادية وعدد البكسل في المنطقة المحددة. كرر العملية الآن ، مع تطبيق نفس العتبة لتحديد شدة الإشارة في الخلية بأكملها.

ثم استخدم هذه البيانات لحساب نسبة الإشارة في المنطقة المحددة إلى تلك الخاصة بالخلية بأكملها. من أجل القياس الدقيق لأحداث الترجمة باستخدام دمج البورميسين ، تم أولا تقييم الظروف المثلى للقياس المحوري. تمت مقارنة طيف من التركيزات مقابل علاج مدته خمس أو عشر دقائق.

تركيز البيورومايسين المقبول لخلايا MRC-5 و HeLa أعلى قليلا مما هو مطلوب لخلايا Huh-7. أنتجت الخلايا التي عولجت لمدة عشر دقائق بتركيزات عالية من البيرومايسين في الغالب عديد ببتيدات بيوروميكول أصغر. يتم نزع فتيل عديد الببتيدات الأصغر بسرعة أكبر ، وهي غير مرغوب فيها.

وهكذا اعتبر وقت الحضانة الأقصر مرغوبا فيه أكثر من ذلك. علاج السيكلوهيكسيميد هو تحكم سلبي فعال ومهم. في خلايا MRC-5 ، تم الكشف عن إشارة بورومايسين ضعيفة فقط بعد العلاج بالسيكلوهيكسميد.

باستخدام القياس الكمي للإشارة المحورية ، يمكن تقييم التوطين العام لعديد الببتيدات النقية المقابلة للبروتينات المركبة حديثا على مستويات مختلفة داخل الخلية. كان التوزيع الكمي للإشارة في جميع أنحاء الخلية ممكنا أيضا. بالنسبة لأي من التقنيتين ، كان من المهم تحديد الإشارة لكل مستوى Z في مكدس الصور لتقييم أحداث الترجمة بدقة في خلية كاملة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم حدث الترجمة في المقصورة الخلوية الفرعية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يوم واحد ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عندما يفكر المرء في هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تركيز البيورومايسين ووقت حضانة المرض أمر مهم.

للحد من الانتشار ، يفضل الحد من وقت الحضانة. من المهم أيضا إدراك أن جودة نوع الحصول على الصورة أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج جيدة. لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء كيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.