التحقيق فون "ويليبراند عامل الفيزيولوجيا المرضية باستخدام" نموذج دائرة تدفق فون ويليبراند عامل-الصفائح الدموية "تشكيل سلسلة"

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة وتحديد عامل فون ويلبراند أو تكوين سلسلة الصفائح الدموية VWF استجابة للإفرازات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا عامل فون ويلبراند والفيزيولوجيا المرضية للجسم الملطف. كما أنه يساعدنا في الإجابة على أسئلة حول الطفرات التي تضعف إطلاق عامل فون ويلبراند ووظيفة ربط الصفائح الدموية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تلخص التفاعلات في الجسم الحي بين الكولاجين البطاني تحت البطاني والخلايا البطانية VWF والصفائح الدموية في نظام بصري وقابل للقياس الكمي. أشعر أن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر حيوي. قد يكون من الصعب إتقان خطوات الفحص المجهري المطلوبة لالتقاط تكوين سلسلة الصفائح الدموية VWF في ظل ظروف متزامنة متعددة في الوقت الفعلي عن طريق النص وحده.

ابدأ بتحميل 0.5 مل من عازلة طلاء الكولاجين في حقنة قفل لور سعة 1 ملليلتر. قم بلف نهاية المحقنة على خزان شريحة غرفة التدفق واضغط على المكبس ببطء حتى يتم طلاء الممر بالكامل ويمتلئ كل خزان. قم بتعبئة الخزانات للتأكد من امتلاء كل خزانة.

عندما يتم تحميل جميع الممرات ، احتضن الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة عازلة طلاء الكولاجين. ثم اشطف كل حارة باستخدام HBSS ، وشفط المحلول الملحي بماصة سعة 200 ميكرولتر.

بعد التخلص من الجولة الثالثة من HBSS ، أضف ما يقرب من ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا البطانية السادسة لنمو الدم لكل مليلتر في 100 ميكرولتر من وسط النمو ، مع استكمال 10٪ FBS لكل حارة من غرفة التدفق. ثم أعد الغرفة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، مع تغيير الوسط كل ثماني إلى 12 ساعة. لتجميع جهاز التدفق ، قم أولا بتوصيل موصل لور الكوع الذكر بأحد طرفي كل قطعة من ثلاث قطع بطول 70 سم من أنابيب السيليكون المعقمة.

وقم بتوصيل محول قفل لور أنثى واحد بالطرف الآخر من كل أنبوب. قم بتوصيل محولات قفل اللور الأنثوية بمحاقن فردية سعة 20 مليلتر وقم ببرمجة مضخة الحقنة. قم بتحميل المحاقن على المضخة ، وقم بتثبيت الأقواس بإحكام حول المحاقن والغطاس.

بعد ذلك ، قم بإرفاق سحر الكوع الفردي للذكور على طرفي ثلاث قطع مختلفة بطول 20 سم من أنابيب السيليكون المعقمة ، وقم بتوصيل إبرة قياس 18 بواحدة من كل من سحر الكوع الثلاثة. بعد ذلك ، على مجهر قرص دوار مزود بمرحلة مؤتمتة بالكامل ، حدد هدف 20x وقم بتعيين إعدادات القناة المناسبة. للحصول على نطاق البيانات الديناميكي الكامل ، اضبط الجهاز المقترن بشحنة مضاعفة الإلكترون على كسب ضرب الإلكترون 150 مع وقت تعرض يبلغ 200 مللي ثانية.

اضبط طاقة الليزر 491 نانو متر على 20٪ واستخدم برنامج المجهر لتحديد مركز جميع الممرات الثلاثة. اضبط نطاق Z على 1.0 ميكرومتر وحجم الخطوة على 0.5 ميكرومتر. أخيرا ، حدد المدة والفاصل الزمني لالتقاط صورة كل 10 ثوان بمعدل 60 نقطة زمنية لكل شريحة.

للحث على تكوين سلاسل الصفائح الدموية VWF ، استبدل وسط الاستزراع من ثلاثة ممرات لغرفة التدفق ، بوسط خال من المصل وحده كعنصر تحكم ، ثم يتم تخفيف المنشط ذي الأهمية في 100 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل إلى الممرات الإضافية. ثم احتضان الغرفة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التحفيز ، اغسل جميع الممرات الثلاثة ب 100 إلى 200 ميكرولتر من PBS ، واستخدم مشابك الأوعية الدموية لتعيين غرفة التدفق على حامل منزلق.

قم بتوصيل موصل لوير ذكر واحد من نهاية قطعة من أنابيب 70 سم بكل خزان من غرفة التدفق. وابدأ مضخة الحقنة لإزالة غسل PBS. ماصة PBS إضافية في خزان غرفة التدفق المقابل لضمان عدم جفاف الممرات.

بمجرد تأكيد التدفق المكافئ ، أوقف مضخة الحقنة مؤقتا. قم بتوصيل حقنة 5 مليليتر بمقرنة قفل أنثوية بأول موصل لوير ذكر مجاني. واغمر الإبرة الخافتة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على محلول الصفائح الدموية المغسول المسمى بالفلورسسنت.

ببطء ، ارسم محلول الصفائح الدموية من خلال الأنبوب للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل النظام. قم بتوصيل اللور الذكر بالخزان المفتوح لغرفة التدفق ، وقم بتحميل المسارين الآخرين بمحلول الصفائح الدموية ، كما هو موضح للتو. تحقق من إعداد نظام التدفق للتأكد من أن جميع التوصيلات آمنة.

أعد تشغيل مضخة الحقنة وقم بتصوير تدفق الصفائح الدموية لمدة 10 دقائق في الظلام. ثم افصل اللور عن أنبوب السحب الموجود في خزان غرفة التدفق. واملأ الخزان ب PBS للحفاظ على تدفق محلول ملحي لطيف فوق طبقة أحادية الخلية البطانية.

لتحديد تشكيل سلسلة الصفائح الدموية VWF، التقط 10 صور لكل شريحة من كل حارة دون تداخل من منتصف الشريحة. عند الحصول على جميع الصور ، افتح برنامج معالجة الصور وانقر فوق الصورة ، اضبط ، وتباين السطوع. لضبط سطوع الصورة الأولى ، اسحب شريط التمرير حتى يمكن عرض الصفائح الدموية الملتصقة جيدا بما يكفي للقياس الكمي.

بعد ذلك ، قم بتسجيل سلسلة VWF-platelet عند ملاحظة ثلاثة أو أكثر من الصفائح الدموية المحاذاة وحساب جميع الأوتار في الصورة. بعد بدء ظروف التدفق ، تظهر الخلايا غير المعالجة عددا قليلا جدا من سلاسل الصفائح الدموية VWF مقارنة بالخلايا المعالجة بالهيستامين أو PMA. والتي تظهر في المتوسط من سلسلتين إلى ثلاث سلاسل لكل مجال رؤية.

علاوة على ذلك ، فإن الهستونات ، التي تنشط الصفائح الدموية وكذلك الخلايا البطانية تحفز إنتاج المزيد من سلاسل الصفائح الدموية VWF أكثر من الضوابط غير المعالجة أو الهيستامين أو PMA. أثناء محاولة هذا الإجراء ، حافظ على هدوء الصفائح الدموية حتى تجربة التدفق عن طريق التخلص من أول أنبوب لجمع الدم ، والحفاظ على جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة واستخدام تقنية ماصة لطيفة. يمكن إجراء تعديلات على هذا الإجراء لتقييم تكوين سلسلة الصفائح الدموية VWF في وجود الكريات البيض أو عوامل تنشيط الصفائح الدموية أو انحلال الخيط بواسطة ذرة الإنزيم المشقوقة TS13.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم تكوين سلسلة الصفائح الدموية VWF الناجم عن الإفرازات ونموذج غرفة التدفق في المختبر.