جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مقايسة تمدد تدفقي بسيطة وقوية وعالية الإنتاجية للجزيء الواحد لدراسة نقل الجزيئات على طول DNA. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير lambda-DNA المسمى بالبيوتين عن طريق ربط أوليغو مسمى بالبيوتين بـ lambda-DNA. والخطوة الثانية هي تحضير شرائح تغطية وظيفية من البولي إيثيلين جلايكول أو PEG باتباع بروتوكول تفاعل من خطوة واحدة.

بعد ذلك، يتم بناء خلية تدفق عالية الإنتاجية عن طريق وضع شريط لاصق مزدوج الجانب يحتوي على قنوات مقطوعة مسبقاً بين شريحة غطاء وظيفية من PEG ولوح من بولي دي ميثيل سيلوكسان أو PDMS يحتوي على فتحات للدخول والخروج. وتتمثل الخطوة النهائية في تتبع مسارات جزيئات فلورية مفردة في قناة التدفق باستخدام التصوير الفلوري بالانعكاس الداخلي الكلي أو TIRF بنظام التصوير المتقطع. ولتحديد مسارات الجزيئات المفردة التي تنتشر على طول DNA-lambda الممدد بالتدفق، يتم استخدام برنامج مخصص وموثوق وفعال لتتبع الجسيمات المفردة لتحليل صور الفلورة الخام.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذا التكوين للمقايسة مقارنةً بالبدائل الأخرى في موثوقية تحضير الغطاء الزجاجي، والقدرة الأعلى على معالجة عدد أكبر من العينات، وتقليل الوقت اليدوي المستغرق في تحضير العينات، وتحليل بيانات غير خاضع للإشراف بشكل أكثر انسيابية. سيقوم بتوضيح هذا الإجراء الدكتور Kan Xiong، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. قبل البدء في هذه المقايسة، قم بتحضير جميع الكواشف اللازمة كما هو موضح في نص البروتوكول.

قم بتسخين مخزون lambda-DNA بتركيز 0.5 milligrams per milliliter إلى 65 degrees Celsius لمدة 60 seconds ثم انقله فوراً إلى ثلج رطب. امزج 100 microliters من محلول lambda-DNA مع two microliters من oligo المسمى بالبيوتين بتركيز 10 micromolar داخل أنبوب طرد مركزي صغير. سخن الخليط عند 65 degrees Celsius لمدة 60 seconds ثم برده ببطء حتى درجة حرارة الغرفة.

ضع الخليط على الثلج. أضف 11 µL من منظم تفاعل T4 DNA ligase وامزجه بلطف. ثم أضف 2 µL ما يعادل 800 units من T4 DNA ligase وامزجه بلطف.

يتم تحضين الخليط لمدة ساعتين عند 16 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم يُنقى المنتج باستخدام أنابيب ترشيح طرد مركزي بحد وزن جزيئي اسمي يبلغ 100 kilodaltons. تُعرض شرائح التغطية رقم 1 للموجات فوق الصوتية في 95% ethanol داخل وعاء صبغ لمدة 10 دقائق، ثم تُشطف بالماء فائق النقاء ثلاث مرات.

املأ وعاء الصبغ بهيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز مولار واحد، ثم استخدم جهاز السونيكاتور لمدة 10 دقائق أخرى، وبعد ذلك اشطفها بالماء فائق النقاء ثلاث مرات. كرر هذه الدورة مرتين. جفف أغطية الشرائح تحت تدفق غاز النيتروجين الجاف والنظيف.

قم بتنظيف وتجفيف شرائح الغطاء بشكل إضافي عن طريق إجراء معالجة بلازما هوائية عند ضغط 900 millitorr لمدة خمس دقائق. قم بحضن شرائح الغطاء مع 50 µL من silane-polyethylene glycol-biotin بتركيز 25 mg/mL المذاب في ethanol بنسبة 95% عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. اغسل فائض polyethylene glycol باستخدام ماء فائق النقاء وجفف شرائح الغطاء المطلية بـ polyethylene glycol تحت تدفق غاز النيتروجين الجاف والنظيف.

قم بتصميم قنوات التدفق باستخدام برنامج CAD وقم بقص القنوات على شريط لاصق مزدوج الجانب باستخدام قاطع الشريط. أزل بقايا الشريط من داخل القنوات. ولتحضير شرائح PDMS، اخلط 45 grams من PDMS جيداً مع خمسة grams من عامل الربط التشابكي باستخدام خلاط.

صب الخليط في طبقين من أطباق بتري بقطر 100 millimeter واترك الأطباق داخل غرفة تفريغ لمدة 30 دقيقة تقريباً حتى تختفي جميع فقاعات الهواء. اترك الأطباق داخل فرن بدرجة حرارة 80 degree Celsius لمدة ساعتين تقريباً حتى يتصلب PDMS. قص شريحة من PDMS تتناسب مع حجم الشريط اللاصق ذي الوجهين الذي يحتوي على قنوات مقصوصة مسبقاً.

قم بإزالة غشاء حماية واحد من الشريط اللاصق مزدوج الوجه وثبته على جانب مسطح من كتلة PDMS. اصنع ثقوب المخرج والمدخل في كتلة PDMS باستخدام مثقاب خزعة بقطر إبرة 23 gauge. قم بإزالة غشاء الحماية الآخر من الشريط اللاصق مزدوج الوجه وثبته على السطح الوظيفي لغطاء الشريحة.

قم بتثبيت خلية التدفق المجمعة على قطعة إدخال في منصة المجهر. قم بتعبئة جميع الكواشف التي تمت إزالة الغازات منها مسبقاً في خزانات متصلة بأنابيب Tygon موصلة بصمام ملف لولبي (solenoid valve)، وأنبوب آخر متصل بأنبوب PEEK لمنع التدفق العكسي للكواشف. يتم التحكم في تدفق الكواشف بواسطة صمامات ملف لولبي يتم تشغيلها عبر تطبيق برمجي.

قم بتحضير قناة تدفق واحدة عن طريق تمرير محلول منظم فارغ (blank buffer) فيها. أدخل ثلاثة أنابيب PEEK أخرى في فتحات الإدخال. كن حذرًا لتجنب تكوّن فقاعات هوائية داخل القناة.

قم بتوصيل أنبوب Tygon بأنبوب PEEK قصير من فتحة المخرج إلى حاوية نفايات العينات. قم بتمرير محلول Streptavidin بتركيز 0.2 milligrams per milliliter واتركه للتحضين لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتمرير محلول منظم فارغ (blank buffer) لغسل الـ Streptavidin غير المرتبط.

قم بتمرير محلول ألبومين المصل البقري بتركيز 1 mg/mL وحضنه لمدة دقيقة واحدة. ثم مرر محلولاً منظفاً (blank buffer) لغسل ألبومين المصل البقري غير المرتبط. بعد ذلك، مرر محلول biotin-lambda-DNA بتركيز 100 pM وحضنه لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، يتم تمرير المحلول المنظم الفارغ لغسل جزيئات lambda-DNAs غير المرتبطة. وللتحقق من جودة الشريحة الغطائية الوظيفية بـ PEG، يتم تمرير صبغة تلوين DNA مثل صبغة SYTOX Orange وبدء التصوير الفلوري. إذا كانت جودة الشريحة الغطائية جيدة، فستكون كثافة جزيئات lambda-DNAs الممددة بتدفق السائل عالية.

كذلك، قم بضبط زاوية TIRF لتحقيق أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء في صور جزيئات lambda-DNA الممتدة تقريبًا بشكل كامل بفعل التدفق. لتتبع مسارات الجزيئات المنفردة، ابدأ عمليات الحضن داخل قناة جديدة، ثم قم بدمج جزيئات موسومة بفلوروفور بتركيز دون النانومولار بمعدل تدفق مرتفع بما يكفي باستخدام مضخة حقنة، واجمع صور فلورية بنظام التصوير الزمني بمعدل إطارات يبلغ 100 Hertz. عادةً ما يتم جمع 10,000 إطار في مجال رؤية واحد، كما يتم جمع مقاطع فيديو من مجالات رؤية متعددة.

في النهاية، يتم تدفق صبغة تلوين DNA مرة أخرى للتأكيد على أن جزيئات DNA لا تزال قابلة للتمدد بالتدفق. سيتم استخدام برنامج مخصص لتتبع الجسيمات الفردية لتحديد مسارات الجزيئات المنفردة التي تنتشر على طول DNA. وسيقوم البرنامج أولاً بتحديد مواقع المركز الهندسي للجسيمات المنفردة بدقة عالية.

قم بإزالة الجسيمات العالقة على سطح غطاء الشريحة، ثم قم بربط الجسيمات الموجودة في الإطارات المختلفة لتكوين مسارات التصوير الزمني. ومن هذه المسارات، سيتم تقدير ثوابت الانتشار أحادية البعد (1D). لبدء تحليل البيانات، افتح تطبيق برمجة النصوص وانتقل إلى دليل برنامج تتبع الجسيمات المنفردة.

افتح نصاً برمجياً باسم largedataprocess3.m. هناك معامل مهم يجب تحديده وهو قيمة العتبة للكشف عن الجسيمات الفردية. ولتحديد قيمة العتبة المثلى، قم بتشغيل determine_threshold_value.

برنامج m script. سيقوم هذا البرنامج بتوضيح كيف تؤثر قيمة العتبة على الكشف عن الجسيمات المفردة. بعد تحديد قيمة العتبة المثلى، قم بتشغيل largedataprocess3.

نص برمجي m. بعد الانتهاء من تحليل تتبع الجسيمات المفردة، سيتم تصفية المسارات الخام عن طريق تشغيل النص البرمجي trajectory_filtering.m.

تم بناء واجهة مستخدم رسومية (GUI) لتصور خطوة الترشيح. في لوحة واجهة المستخدم الرسومية، اضبط الحد الأدنى للإزاحة على طول DNA، MinXDisp، على بكسلين. واضبط الحد الأقصى للإزاحة المستعرضة لـ DNA، MaxYDisp، على بكسلين.

اضبط الحد الأدنى لعدد الإطارات، minFrames، على 10. واضبط الحد الأدنى لعدد حالات الثلاثية، minTriplets، على 10. واضبط الحد الأدنى لثابت الانتشار على طول DNA، D_par، ليكون صفراً.

اضبط الحد الأقصى لثابت الانتشار التقديري العرضي بالنسبة للحمض النووي DNA، D_trans، على 10 mega base pair squared per second. واضبط الحد الأدنى لمعلمة الإحصاء، Chi2 Stat، على سالب خمسة. ثم اضبط الحد الأدنى لنسبة الإزاحة على طول الحمض النووي DNA إلى تلك العرضية بالنسبة للحمض النووي DNA، MinX/Y، على اثنين.

سيتم إدراج جميع المسارات الخام التي تجتاز معايير التصفية هذه في الجدول 1، بينما ستُدرج المسارات التي لا تجتازها في الجدول 3. انقر فوق رقم المسار في الجدول 1، وسيتم عرض المسار في الشكلين الرسوميين 1 و2.

انقر على زر التشغيل لعرض صور الفلورية الخام. انقر على "إضافة إلى الجدول 2" (add to table2) إذا كان هذا المسار يمثل مسار انزلاق لجزيء واحد. في النهاية، سيتم حفظ جميع المسارات المضافة إلى الجدول 2 عند إغلاق واجهة المستخدم الرسومية (GUI).

يتم تجميع المسارات التي اجتازت جميع خطوات الترشيح معاً لتقدير متوسط ثابت الانتشار منها. ولحساب متوسطات ثوابت الانتشار، قم ببساطة بتشغيل السكربت calculate_mean_diffusion_constant.m. سيفيد هذا الإجراء العديد من الباحثين الذين يدرسون الفيزياء الحيوية للجزيء الواحد في المختبر.