تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد الموضع الكروموسومي الأمثل لأي عنصر معين من عناصر الحمض النووي باستخدام الإدخال العشوائي بوساطة الينقولات ، وتجارب المنافسة وتسلسل الجينوم الكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكرار الحمض النووي مثل أهمية موقع الكروموسومات للعنصر الجيني. ميزة هذه التقنية هي أن أزواج الإدخال العشوائي القائم على الينقولات مع اختيار استنساخ أنسب من خلال ميزة النمو.

هنا ، تم تبسيطه بواسطة منطقة الإشريكية القولونية DARS2. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على تنظيم الكروموسومات للإشريكية القولونية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على البكتيريا الأخرى. بعد تحضير الخلايا الكهروبية مثل MG1655 delta DARS2 وفقا لبروتوكول النص ، أضف ميكروغراما واحدا من pNKBOR DARS2 إلى 40 ميكرولترا من الخلايا وانقل الخليط إلى كوفيت معقم بفجوة 0.2 سم مبرد مسبقا.

أدخل الكوفيت في حجرة التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، قم بالكهرباء للخلايا عند 18 كيلو فولت و 500 أوم و 25 ميكروفاراد. يجب أن يكون ثابت الوقت حوالي خمسة مللي ثانية ويجب ألا يحدث انحناء.

استرجع المعلق البكتيري بسرعة عن طريق إعادة تعليقه في مليلتر واحد من مرق LB الدافئ مسبقا ونقله إلى أنبوب اختبار سعة 15 مل. احتضان الخلايا في ظروف النمو الهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون اختيار المضادات الحيوية. بعد ذلك ، ضع البكتيريا على ألواح أجار LB المكملة ب 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الكاناميسين واحتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، عد المستعمرات من التثقيب الكهربائي. تعتبر مستعمرة واحدة مساوية لإدخال منقولات كروموسومية واحدة. أضف ملليلتر واحد من مرق LB إلى كل طبق واغسل جميع المستعمرات.

أعد استخدام نفس المليلتر الواحد من مرق LB لزيادة تركيز البكتيريا. بعد ذلك ، قم بتجميع جميع المستعمرات في نفس الأنبوب سعة 50 مل. دوامة الأنبوب لتجميد المواد الأولية وخلط مليلتر واحد من تعليق الخلية مع ملليلتر واحد من 50٪ جلسرين على الجليد.

انقل الأنابيب إلى الثلج الجاف لمدة 10 دقائق. بمجرد تجميد الثقافات ، انقلها إلى فريزر سالب 80 درجة مئوية. قم بإذابة مكتبة الينقولات من سالب 80 درجة مئوية على الجليد.

امزج عن طريق سحب العينات ، ثم انقل 100 ميكرولتر من مكتبة الينقولات إلى 10 ملليلتر من LB في أنبوب اختبار سعة 15 مل. تنمو الخلايا التهوية مع الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات إلى المرحلة الثابتة. اضبط المعلمات على ظروف النمو المختلفة حسب الرغبة.

لتكاثر البكتيريا كل 10 أجيال تقريبا ، انقل 10 ميكرولترات من المرحلة الثابتة سابقا إلى 10 ملليلتر من الوسط الطازج الدافئ مسبقا وقم بتنمية الثقافة لمدة ثماني ساعات أخرى إلى المرحلة الثابتة. بعد كل 100 جيل من المنافسة ، احفظ خمس عينات سعة ملليلتر واحد وقم بتخزينها في سالب 80 درجة مئوية. قم بإعداد المسبار للبقعة الجنوبية ضد قسم سعة كيلوبايت واحد من NKBOR عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات محددة كما هو موضح هنا.

قم بتشغيل العينات باستخدام البرنامج التالي. قم بتسمية جزء PCR الناتج باستخدام dATP المسمى P32 باستخدام نظام التمهيدي العشوائي وفقا لسميث وقم بإعداد الحمض النووي الخلوي الكلي وفقا لبروتوكول النص. استيعاب الحمض النووي الخلوي الكلي باستخدام Pvul الذي يقطع NKBOR الذي يحتوي على منطقة الاهتمام خارج المنطقة التي يغطيها المسبار.

قم بإجراء لطخة جنوبية باستخدام 0.7٪ جل agarose وفقا ل Loebner-Olsen و von Freiesleben. لاستخدام المشي الجيني السهل لتحديد مواقع إدخال DARS2 من المستنسخة الفردية ، بعد 700 جيل تقديري من المنافسة ، قم بعزل الحمض النووي الجيني لقالب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق نشر البكتيريا أولا على صفيحة أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتلقيح مرق LB بمستعمرات مفردة وزراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

ثم انقل 20 ميكرولترا إلى 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. دوامة المستعمرات في محلول ، ثم سخني الخليط على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للعينات بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق ، ثم احفظ محللة الخلية عند سالب 20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

بعد ذلك ، قم بتصميم ثلاثة بادئات متداخلة لتلدين داخل الينقولات المفضلة كما هو موضح هنا. استخدم 200 نانوجرام من الحمض النووي الجيني ، والتمهيدي المتداخل الأول ، والتمهيدي العشوائي لإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 20 ميكرولتر. ثم قم بتشغيل العينات باستخدام البرنامج التالي.

بالنسبة للتضخيم الثاني ، استخدم ميكرولتر واحد من التفاعل الأول كقالب واستخدم التمهيدي المتداخل الثاني ونفس التمهيدي العشوائي. قم بإجراء تفاعل ثالث بطريقة مماثلة باستخدام التمهيدي المتداخل الثالث ، ونفس التمهيدي العشوائي وميكرولتر واحد من التفاعل الثاني مثل القالب. قم بتشغيل المنتجات من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي على جل الاغاروز بنسبة 1.5٪ والستاتين مع بروميد الإيثيديوم.

قم بقص نطاق في حدود 100 إلى 800 زوج أساسي وعزل الحمض النووي باستخدام أي مجموعة استخراج هلام الحمض النووي التجارية وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. لإجراء قياس التدفق الخلوي ، قم بموازنة كل ثقافة بكتيرية عن طريق الحفاظ عليها في مرحلة النمو الأسي لمدة 10 أجيال على الأقل. قم بقياس OD600 وتأكد من أنه لا يتجاوز 0.3 أبدا.

لتنفيذ نفاد الريفامبيسين وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقل مليلتر واحد من المزرعة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 30 ميكرولتر من RIF-CEF. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة أربع ساعات على الأقل. بالنسبة لعينة EXP ، قم بنقل مليلتر واحد من الثقافة المتنامية بشكل كبير إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر على الجليد.

ثم ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 15،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الثلج البارد 10 ملليمولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 وإضافة مليلتر واحد من المثلج البارد 77٪ الإيثانول. قم بتخزين العينات على أربع درجات مئوية حتى الاستخدام.

تلطيخ الخلايا عن طريق حصاد 100 إلى 300 ميكرولتر من الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي عند 15،000 مرة G لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية واستخدم 130 ميكرولترا من محلول تلطيخ الحمض النووي لإعادة تعليق الحبيبات. ثم احتضان العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 10 دقائق.

أخيرا ، استخدم قياس التدفق الخلوي لتحديد الأصل لكل خلية وكتلة الخلية النسبية ومحتوى الحمض النووي النسبي. بعد استخراج الحمض النووي من مجموعة الينقولات الأولية وكل ما يقدر بنحو 100 من أصل 700 جيل من المنافسة ، تم قطع الحمض النووي باستخدام Pvul المعروف بقطع الينقولات NKBOR DARS2 مرة واحدة في منطقة لا يغطيها المسبار وتم إجراء وصمة عار جنوبية. كما هو موضح هنا ، يفتقر تجمع DARS2 الأولي إلى نطاقات مميزة مما يدل على أن DARS2 تم إدخاله بشكل عشوائي في جميع أنحاء الكروموسوم.

بمرور الوقت ، ظهر نمط حيث تطورت المجموعة الكبيرة الأولية من استنساخ DARS2 إلى نسخة واحدة فقط أو عدد قليل من استنساخ DARS2 المستمرة. تم استخدام تسلسل الجينوم الكامل لتحديد مواقع إدخال DARS2 من تجمع البداية. وبعد 400 و 500 و 700 جيل من المنافسة في مجموعة فرعية تمثيلية من تسلسل الإدراج ، تم العثور على 98٪ من جميع عمليات إدخال DARS2 بالقرب من موقع الكروموسومات DARS2 من النوع البري.

و 2٪ تم العثور عليها في مكان آخر على الكروموسوم. تبين سابقا أن الخلايا التي تعاني من نقص في DARS2 تبدأ النسخ المتماثل في التزامن ولديها انخفاض في تركيز الأصل بالنسبة للخلايا البرية. هنا ، لا يؤدي وجود عنصر DARS2 في النهاية إلى استعادة التزامن أو محتوى الأصل الخلوي إلى مستويات النوع البري بينما تبدأ استنساخ DARS2 المحددة IR و RPPH النسخ المتماثل بشكل متزامن.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الموضع الكروموسومي الأمثل لعنصر DNA معين. يتم ذلك عن طريق الإدخالات العشوائية القائمة على الينقولات متبوعة بتجارب المنافسة وأخيرا تسلسل الجينوم الكامل.