التحليل الآلي من النيماتودا القائم على السكان الحسية الكيميائية تفضيل التفضيل

الهدف العام من إعداد وبروتوكول تسجيل السلوك هذا هو تحديد التفضيل الحسي الكيميائي القائم على السكان ل C Elegans للمركبات القابلة للذوبان باستخدام نظام الحصول على الفيديو متعدد الكاميرات ، متبوعا بتحليل الفيديو الآلي. يمكن أن تسهل هذه الطريقة أبحاث البيولوجيا العصبية في C Elegans من خلال تمكين التحليل السلوكي الأسرع والأكثر توحيدا للطفرات الجينية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن فحص التكرارات المتعددة في وقت واحد في ظل ظروف متطابقة مع مراقبة الديناميكيات الزمنية لاستجابة سكان الديدان الخيطية للإشارات القابلة للذوبان.

سيظهر كريستوفر كرونين ، عالم من هذا المختبر ، وهو عالم من هذا المختبر. للبدء ، قم بإعداد أغطية القماش وقضبان تثبيت الكاميرا وأقواس الزوايا وقضبان البثق ومجموعة حامل الكاميرا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بدءا من القضبان الطرفية المتصلة بالشريط المركزي، قم بتوصيل حامل الكاميرا والحافظات بمجموعة حامل الكاميرا.

بعد ذلك ، قم بتجميع إطار غرفة السلوك. ابدأ بربط أربعة قضبان ألومنيوم بثق قدم واحدة بصفائح بوليستر مربعة. حرك شريطا واحدا على صواميل T من أومني لوح القماش ، مع توسيط الشريط على طول عرض القماش.

شد السحابات لتثبيت ورقة القماش في كل شريط. انشر لوح البوليستر المربع على سطح العمل مع وجود قضبان الألمنيوم الأربعة المرفقة في الأعلى. بعد ذلك ، ضع ثمانية أقواس زاوية على الأسطح العلوية لقضبان الألمنيوم الأربعة ، واحدة في كل طرف من طرفي كل شريط.

ضع أقواس الزاوية على القضبان مع مسح الأرجل الرأسية للحامل بنهاية القضبان وقم بتثبيتها في مكانها عن طريق شد البراغي في صواميل T. في كل زاوية ، قف بثق من الألومنيوم بطول قدم واحدة في وضع مستقيم ، مع انزلاق البثق فوق صواميل T على ساقي قوس الزاوية. بعد ذلك ، قم بتأمين الشريط المستقيم على القضبان الأفقية عن طريق شد السحابات ، وبالتالي الانضمام إلى الشريطين الأفقيين المتجاورين.

قم بتمرير صواميل T السائبة لمجموعة حامل الكاميرا على شكل حرف H لأسفل في قوائم الإطار. دع H ينزلق لأسفل ليستقر أعلى أقواس الزاوية في كل ركن من أركان الإطار. قم بتثبيت مجموعة حامل الكاميرا في مكانها ، عن طريق شد مسامير حامل الزوايا الأربعة.

بعد ذلك ، استخدم قضبان الألمنيوم الأربعة الأخيرة التي يبلغ طولها قدم واحدة لتجميع الطبقة السفلية من الغرفة. ضع أقواس الزاوية مع مسح أرجل الأقواس بنهاية الشريط وشد البراغي لتثبيتها في مكانها. بعد ذلك ، قم بتحريك القضبان لأسفل بين قوائم الإطار باستخدام صواميل T السائبة في القنوات المستقيمة.

ضع الشريط بحيث تكون الحواف العلوية لأقواس الزاوية بوصة واحدة أسفل الطرف المفتوح للقوائم وتثبيتها في مكانها عن طريق شد مسامير قوس الزاوية. بعد ذلك ، حرك صواميل T لألواح البوليستر المستطيلة الأربعة لأسفل في قنوات قضبان البثق المستقيمة لتغطية جوانب الغرفة وشد السحابات لتثبيتها في مكانها. حدد جانبا واحدا ليكون بابا للوصول إلى الجزء الداخلي من الغرفة وقم بإزالة المسمارين وصواميل T في الطبقة السفلية من الغرفة.

ضع غطاء بلاستيكي في الطرف العلوي من كل زاوية ليكون بمثابة أقدام للإطار المكتمل. اقلب الإطار على الجانب الأيمن لأعلى وأدخل حاملي لوحة لكل شريحة داخل طبقة مساحة الإطار، ولفهما لتثبيتهما في مكانهما. بعد ذلك ، ضع قطعة من الأكريليك الشفاف مقاس 12 × 12 بوصة أعلى حاملات الألواح لتوفير مرحلة لألواح الفحص.

أخيرا، ضع الكاميرا وقالب المسرح كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. في اليوم السابق للتجربة ، ضع 28 لوحا فارغا مقاس 35 ملم في أكوام من خمسة أو أقل على سطح مستو. املأ كل لوحة فحص بخمسة ملليلتر من أجار وسائط نمو الديدان الخيطية واترك ألواح الفحص لتجف في وضع مستقيم مع إغلاق أغطيتها ، طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في يوم التجربة ، قم بتشغيل الإضاءة الخلفية ، وقم بتشغيل الكمبيوتر وقم بتشغيل برنامج التقاط الفيديو الخاص بكاميرا المجهر. قم بتوصيل كاميرا المجهر بالكمبيوتر وانقر على الصورة المصغرة للكاميرا المرقمة في الجزء العلوي من نافذة البرنامج لعرض البث المباشر للكاميرا. لضبط إعدادات تسجيل الفيديو ، اسحب قائمة تنسيق الفيديو لأسفل في الزاوية العلوية اليسرى من موجز الكاميرا ، وحدد MJPG 1280x1024.

بعد ذلك ، اسحب قائمة المجلد بجوار قائمة تنسيق الفيديو ، وحدد مجلدا لحفظ ملفات الفيديو فيه. انقر فوق رمز التعريض التلقائي في الزاوية اليمنى العليا من موجز الكاميرا وقم بإيقاف تشغيل التعريض التلقائي. ثم انقر فوق أيقونة LED مباشرة على يمين أيقونة التعريض التلقائي لإيقاف تشغيل مصابيح LED المدمجة لكاميرا المجهر.

انقر فوق رمز الإعدادات المجاورة وحدد أحادي اللون. قم بزيادة التباين إلى أقصى حد ، واضبط السطوع. قم بمحاذاة قالب وضع الحل أعلى قالب محاذاة لوحة المسرح وانقر على أيقونة تسجيل الفيديو بفاصل زمني على الجانب الأيسر من تغذية الكاميرا.

أدخل خمس ثوان لمدة وثواني واحدة للفاصل الزمني لتسجيل فيديو معايرة لمدة خمس ثوان بمعدل إطار واحد في الثانية. استخدم ماصة زجاجية سعة خمسة ملليلتر لإضافة 1.2 مل من المخزن المؤقت لوسائط نمو الديدان الخيطية إلى صفيحة من الديدان المتزامنة وتحريك اللوحة برفق لإزاحة الديدان في المخزن المؤقت. ماصة عازلة من اللوحة وتوزيع الديدان في المخزن المؤقت في أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق.

دع الأنابيب تقف لمدة دقيقة إلى دقيقتين للسماح للديدان بالاستقرار في القاع. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة بلاستيكية لإزالة أكبر قدر ممكن من عازلة الغسيل من الأنابيب دون إزعاج حبيبات الديدان المتراكمة في قاع الأنابيب. أعد ملء الأنبوب بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لوسائط نمو الديدان الخيطية النظيفة وكرر إجراء الغسيل مرتين أخريين.

بعد ذلك ، قم بلصق قالب وضع المحلول أعلى مرحلة مجهر التشريح. بعد ذلك ، ضع شريطا من الشريط على الوجهين على جانبي قالب محاذاة اللوحة. قم بمحاذاة محيط لوحة الفحص مع الدائرة الموجودة على قالب محاذاة اللوحة واضغط لأسفل حتى يلتصق القالب بأسفل اللوحة.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة علامات أعضاء قالب لوحة الفحص مع علامات عضو قالب موضع المحلول على مجهر التشريح. بعد ذلك، استخدم ماصة P2 لوضع ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت M13، كل منها في الأربعين الأول والأربعة. استخدم طرفا جديدا لوضع ميكرولتر واحد من محلول CuCl2 سعة 10 ملليمولار في أرباع اثنين وثلاثة.

استخدم ماصة باستور زجاجية لنقل الديدان المغسولة إلى ألواح الفحص بمجرد امتصاص قطرات المحلول بالكامل في الأجار. ضع قطرة من الديدان على المناطق الموجودة أعلى وأسفل المناطق المعالجة الدائرية. قم بطي الأنسجة أربع مرات واستخدم الحافة الحادة لامتصاص المخزن المؤقت للغسيل الزائد على ألواح الفحص.

قم بترتيب لوحات الفحص على الفور تحت كاميرات المجهر في الغرفة السلوكية عن طريق محاذاة أرقام زوايا القالب. انتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح للديدان بالتأقلم مع لوحات الفحص. بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة تسجيل الفيديو بفاصل زمني على الجانب الأيسر من موجز الكاميرا وأدخل 10 دقائق لمدة وثانية واحدة للفاصل الزمني لتسجيل فيديو مدته 10 دقائق بإطار واحد في الثانية.

أخيرا ، انقر فوق ابدأ لبدء تسجيل الفيديو. لكل إطار فيديو، تحسب دالة فهرس التفضيلات عدد وحدات البكسل الدودية في كل منطقة محل اهتمام وتحسب النسبة المئوية لبكسل واحد من إجمالي عدد وحدات البكسل في المنطقة المعنية. يتم عرض قيم مؤشر التفضيل التي تم الحصول عليها لأزواج النمط الجيني والمعالجة المختلفة هنا.

قيمة مؤشر التفضيل الإيجابي إلى الانجذاب إلى العلاج بينما تشير قيمة مؤشر التفضيل السلبية إلى التنافر. يتم الحصول على مؤشر تفضيل 0.02 عندما تم وضع محلول المخزن المؤقت M13 في كل من مناطق التحكم والتجربة ذات الاهتمام ، مما يدل على عدم وجود تحيز مكاني. يوضح هذا الرسم البياني أيضا أن N2 ديدان تجنبت بقوة أيونات النحاس ، مما أدى إلى مؤشر تفضيل قدره 0.67.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن osm-3 ، المعيبة في تكوين الأهداب الحسية ، والطفرات ocr-2 المعيبة في استجابات استقبال الألم بوساطة ASH أظهرت انخفاضا في التجنب وحتى بعض الانجذاب الخفيف لأيونات النحاس. أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم العمل بسرعة ولكن أيضا بسلاسة ومتسقة. يمكن تكييف إعداد التسجيل وبروتوكول الفحص بسهولة لتوصيف الاستجابات السلوكية القائمة على السكان والتي تنشأ من التفاعلات بين الأصناف الحسية المختلفة ل C Elegans.