التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

الهدف العام من طريقة الاستزراع المتباعدة للموائع الدقيقة ، هو زراعة النباتات مباشرة من البذور في بيئة منظمة يمكن استخدامها أيضا للمعالجة الخاضعة للرقابة والتصوير عالي الدقة لجذور الشتلات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النبات مثل كيفية استجابة نمو جذر النبات للإشارات الفيزيائية والكيميائية بمقاييس طول متعددة. الميزة الرئيسية لهذه المنصة هي أن الإصلاحات تقتصر على سهل واحد ، مما يجعل من المستحيل معالجتها وتصويرها دون فقدان التركيز البصري.

ستساعدني اليوم الدكتورة سحر حسيم ، وهي أستاذة باحثة مشاركة في جامعة تينيسي. للبدء ، صب نسبة 10: 1 من PDMS إلى عامل المعالجة على رقاقة رئيسية مسبقة الصنع وسلين. قم بإزالة PDMS في غرفة مفرغة ثم قم بمعالجة البوليمر في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، استخدم مشرطا لقطع أجهزة PDMS وتقشيرها من السيد. بعد ذلك ، استخدم خزعة سعة 1.5 مل لثقب مدخل البذور بزاوية 45 درجة ، لتشجيع نمو الجذور في القناة الرئيسية. أيضا ، استخدم نفس الثقب لمسح مداخل العلاج.

استخدم شريطا لاصقا لإزالة أي حطام من الجهاز ووضعه على جانب التصميم لأسفل على شريحة غطاء زجاجي. بمجرد تجميعها ، قم بتعقيم الأجهزة. ضع بذور نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا في أنبوب ميكروفوجوج وأضف مزيجا من المبيض والمنظفات لتعقيم البذور.

ثم اغسل البذور أربع مرات بالماء المعقم. بعد ذلك ، قم بتقسيم البذور إلى طبقات عن طريق تبريدها في أنبوب الطرد الدقيق طوال الليل أو تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع عند أربع درجات مئوية. قبل استخدام الأجهزة المعقمة ، ضعها في غرفة تفريغ الغاز الفراغي ، لإزالة الهواء من PDMS النفاذية للغاز والقنوات السائلة.

سيؤدي ذلك إلى تحسين التعبئة اللاحقة للأجهزة. قم بإزالة الأجهزة من حجرة التفريغ واغمرها على الفور في طبق بتري مملوء بوسائط سائلة ذات قوة ربع نباتية ، عند درجة حموضة 5.7. باستخدام ماصة، اسحب السائل عبر المداخل لملء الجهاز.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل القنوات عن طريق فحصها بصريا قبل نقلها إلى أطباق بتري الطازجة والجافة. بعد ذلك ، اسكب الأجار الساخن حول الجهاز حتى يصبح مستوى الأجار متدفقا تقريبا مع الجزء العلوي من الجهاز. في بيئة معقمة ، استخدم ماصة صغيرة وانقل بذرة واحدة معقمة إلى مدخل كل جهاز.

بعد ذلك ، قم بتغطية كل طبق بتري بغشاء شمعي وضعه في غرفة نمو دورة داكنة فاتحة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوجيه طبق بتري في غرفة النمو في درجة حرارة الغرفة ، عموديا ، بحيث تشجع الجاذبية الجذور على النمو عبر القناة. في الوقت المطلوب وتطور الشتلات ، استخدم ماصة لإضافة كمية محددة من المعالجة التجريبية إلى كل من المنافذ الجانبية الثمانية على الأجهزة.

عند الانتهاء ، أعد إغلاق أطباق بتري بغشاء الشمع. ثم أعدهم إلى غرفة النمو. اضبط تكبير مجهر المجال الساطع المقلوب ، بتكبير يتراوح بين 4x و 20x.

ضع طبق بتري بالكامل الذي يحتوي على الجهاز والشتلات تحت المجهر للحصول على تصوير تباين المجال الساطع أو التداخل التفاضلي. قم بتحسين ظروف الإضاءة عن طريق ضبط أوقات التعريض الضوئي وسطوع المصباح وفتحة العدسة وقطبية الضوء لتوضيح الميزات المورفولوجية ذات الأهمية. بعد ذلك ، قم بقيادة المسرح إلى المنطقة المرغوبة من الجذر وركز على شعر الجذر أو الجذر الذي يثير اهتمامه.

احصل على نقطة زمنية واحدة أو سلسلة زمنية من الصور لتصور نمو شعر الجذور. بالنسبة للسلسلة الزمنية ، قم بتصوير شعر الجذر المتنامي مرة واحدة في الدقيقة. لتصور نمو الجذر الرئيسي ، احصل على صورة واحدة كل 30 دقيقة.

عند الانتهاء ، أعد طبق بتري والشتلات إلى غرفة النمو في وضع رأسي. بمجرد أن تنمو الشتلات للوقت المطلوب ، استخدم زوجا من الملقط لإزالة زلة الغطاء والجهاز من الأجار. بعد ذلك ، بلل أنسجة المختبر بالإيثانول واستخدمها لتنظيف الجزء السفلي من زلة الغطاء.

ضع الزيت المناسب على هدف غمر الزيت 63x وضع انزلاق الغطاء لأسفل على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، ارفع المسرح للاتصال بوسائط الانغماس في الهدف. قم بتحسين ظروف الإضاءة ، عن طريق ضبط أوقات التعريض الضوئي وسطوع المصباح وفتحة العدسة وقطبية الضوء.

بعد ذلك ، قم بقيادة المسرح إلى المنطقة المرغوبة من الجذر وركز على شعر الجذر المثير للاهتمام. لتحديد نمو شعر الجذور بمرور الوقت ، قم بإعداد البرنامج للحصول على صورة واحدة في الدقيقة ، في موقع الاهتمام. من أجل تصور علامات التألق التلقائي للنبات أو علامات التألق ، قلل من وقت التعرض للمضان ، مع الاحتفاظ بإشارة فلورية يمكن التعرف عليها.

احصل على صور للعضيات بأسرع ما يسمح به وقت التعرض. بمجرد أن تنمو الشتلات للفترة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة الجهاز وغطاء زلة من طبق بتري. اقلب الجهاز رأسا على عقب وانزع زلة الغطاء برفق حتى يظل الجذر داخل قناة PDMS.

ضع جهاز PDMS على ركيزة عاكسة مسطحة ، مثل الطلاء الدقيق بالذهب ، ثم قم بتركيب الجهاز على حامل عينة AFM ، بحيث يكون جانب الجذر لأعلى. بعد تثبيت ملحق بئر سائل أعلى جهاز PDMS ، املأه بالماء للحفاظ على رطوبة الجذور أثناء التصوير. بمجرد تحميل العينة في AFM ، اضبط عنصر التحكم z لسمك جهاز PDMS وقم بتوجيه الكابول إلى المنطقة ذات الاهتمام على الجذر.

باستخدام كاميرا للتوجيه ، قم بمحاذاة الليزر مع طرف الكابولي واستخدم تصوير وضع التلامس لممارسة الحد الأدنى من القوة على الجذر أثناء المسح. قم بخفض آلية المسح ببطء حتى يتلامس الكابول مع العينة. بعد ذلك ، اضبط حجم المسح للمنطقة المطلوبة واختر سرعة مسح سطر واحد في الثانية مع 256 نقطة جهد لكل سطر.

أخيرا ، احصل على الفحص. تحتوي أجهزة الموائع الدقيقة PDMS المكونة من طبقتين الموصوفة هنا على قناة مركزية بارتفاع 200 ميكرومتر لجذر نبات الأرابيدوبسيس الرئيسي وغرفتين جانبيتين بارتفاع 20 ميكرومتر ، لحصر شعر الجذور الذي ينمو جانبيا. هذا يضمن أن تكون شعيرات الجذر على نفس مستوى التصوير ، مثل الجذر الرئيسي.

داخل منصة الموائع الدقيقة ، يمكن قياس شعر الجذر على المستوى الخلوي ، من حيث طولها وكثافتها وزاوية نموها من الجذر. واحدة من أقوى مزايا استخدام منصة الموائع الدقيقة ، هي القدرة على إضافة تركيزات دقيقة بشكل موحد من المعالجات الكيميائية إلى الكائنات الحية. هنا ، يتم تصوير الشتلات قبل وبعد إضافة حبات البوليسترين الفلورية ذات الكربوسيلات.

إضافة هذا العلاج اللاأحيائي ، لم يعطل اتجاه التركيز البصري لشعر جذر الشتلات. باستخدام علامات الفلورسنت ، يمكن رؤية التدفق السيتوبلازمي في شعر الجذر. يتم التقاط حركة هذه العضيات الثلاث في مخطط التوزيع التراكمي هذا.

بالإضافة إلى التصوير البصري ، تسمح هذه المنصة أيضا بتصوير AFM و SEM ، نظرا لقدرتها على التفكيك ، دون إزعاج الجذر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى بما في ذلك التصوير الكيميائي للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف تبدو الملامح الكيميائية حول الجذر.