طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

الهدف العام من نقل الجينات الناقلة للفيروس المرتبط بالغدة هو التلاعب وراثيا بدماغ الفئران والحبل الشوكي على نطاق واسع على نطاق واسع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقل الجينات. إنها طريقة فعالة للغاية لإدخال الجينات في الجسم الحي ، وبالتالي فهي تقنية قوية جدا ومتعددة الاستخدامات.

هذا الإجراء سريع وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. لقد استخدمنا هذا النهج الواسع النطاق لنقل الجينات للتعبير عن البروتين المرتبط بالتصلب الجانبي الضموري في جميع أنحاء الحبل الشوكي للفئران في العديد من المنشورات. سيقوم زميلي روبرت دايتون بعرض الإجراء.

سيساعد ميشال جرامس روبرت. ابدأ بإعداد محطة العمل ، أولا ، قم بتنظيف السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضع وسادة تدفئة في منطقة العمل واضبطها على درجة حرارة 37 درجة مئوية.

ضع وسادة مقعد أعلى وسادة التدفئة. تأكد من وجود ما يكفي من الأكسجين والأيزوفلوران للإجراء. نظف حجرة الحث وقناع التخدير بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع قناع التخدير على وسادة المقعد.

تأكد من أن ما يلي في متناول اليد ، مربع فيلم بارافين واحد بحجم حوالي 5 × 5 سم لكل ، ووسادة تحضير كحولية واحدة واثنين أو ثلاثة وسادات شاش لكل ، وأطراف ماصة وماصة دقيقة. بعد ذلك ، قم بإذابة المتجه في درجة حرارة الغرفة وقم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق معقم لكل. ماصة الحجم المطلوب من AAV في الأنبوب المناسب ورفع الحجم إلى حجم الحقن المطلوب باستخدام محلول جرس مرضع أو محلول ملحي.

بعد دوامة العينة لمدة ثانية أو ثانيتين ثم نبض جهاز الطرد المركزي لمدة خمس ثوان لإحضار العينة إلى قاع الأنبوب. الماصة حجم الحقن الكلي خارج الأنبوب وعلى مربع فيلم البارافين. بعد ذلك ، ضع إبرة قياس 30 على حقنة سعة مليلتر واحد.

ضع الإبرة بحيث يكون الشطبة متجهة لأسفل في المتجه على فيلم البارافين. اسحب مكبس المحقنة للخلف حتى يصبح كل الفيروس في الإبرة والحقنة. تخدير الفئران بشكل صحيح باستخدام نظام التخدير.

تأكد من مستوى تخدير مناسب من خلال عدم وجود رد فعل على قرصة إصبع القدم. ثم ضع الجرذ في منطقة العمل على جانبه وحافظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف. مع استلقاء الجرذ على جانبه ، يجب أن يكون أحد وريد الذيل الجانبي متجها لأعلى.

الحقن هو الثلثين أسفل طول الذيل. امسح موضع الحقن بفوسادة تحضير الكحول. أمسك الذيل بإحكام فوق منطقة الحقن قليلا ، بإصبع واحد مباشرة فوق وريد الذيل الجانبي ، سيؤدي ذلك إلى توسيع الوريد.

مع توجيه الشطبة لأعلى ، قم بمحاذاة الإبرة مع وريد الذيل المرئي في نفس الاتجاه. اخترق الجلد فوق وريد الذيل ، مع الحرص الشديد على تجنب إمساك اليد الأخرى بالذيل والضغط على وريد الذيل. حرر الضغط من وريد الذيل للسماح بتدفق الدم الطبيعي.

ثم حرك الإبرة في الوريد. للتأكد من أن الإبرة قد ثقبت الوريد الذيل ، اسحب قليلا على المكبس. إذا كانت الإبرة في الوريد ، فسوف يتدفق الدم إلى الإبرة.

بعد إعادة وضع الإبرة إذا لزم الأمر ، قم بتثبيت الإبرة عن طريق تثبيت نهاية المحقنة على الذيل. قم بحقن الناقل ببطء في الذيل بحوالي 20 ميكرولتر في الثانية. في حالة الحقن السيئ ، سيتم نقل جزئيا فقط وربما لن تكون النتائج مفيدة.

ومع ذلك ، مع الممارسة ، فإن الحقن الجيد قابلة للتكرار وموثوق بها. إذا تم إعطاء الناقل، فقم بإزالة الإبرة من الذيل واضغط على وسادة شاش على موقع الحقن للمساعدة في وقف النزيف لمدة 30 إلى 60 ثانية. قم بإيقاف تشغيل تخدير الأيزوفلوران والأكسجين.

راقب الجرذ حتى يستعيد وعيه ثم أعده إلى قفصه. تخلص من المواد التي قد تكون ملوثة ب AAV في حاوية مناسبة للمخاطر البيولوجية ونظف محطة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. احصل على أقسام إكليلية بحجم 50 ميكرون من الدماغ الثابت والمحمي بالتبريد لحيوان محقون ب AAV ، باستخدام ميكروتوم منزلق مع مرحلة التجميد.

بعد التلوين المناعي ل GFP والتركيب على الشرائح ، قم بتصوير كل قسم في منطقة الاهتمام المحددة باستخدام عدسة تكبير منخفضة باستخدام المجهر. حافظ على إعدادات الكاميرا كما هي في جميع العينات المراد تحليلها وحفظ البيانات كملفات TIFF. افتح الصورة المجهرية في برنامج Scion Image المتاح على نطاق واسع.

سيتم فتح نافذتين ، أغلق النافذة المشار إليها كلون الفهرس. اختر الخيارات ، ثم شريحة الكثافة. ستتم الإشارة إلى مجموعة من الظلال باللون الأحمر في نافذة جدول البحث.

في النافذة، استخدم المؤشر لملء تسمية GFP المحددة فقط وتوقف عندما تبدأ الخلفية غير المحددة في الالتقاط في الصورة. بعد ذلك ، انقر فوق تحليل وتعيين المقياس. يجب أن يقول السطر الرابع الوحدات ، من القائمة المنسدلة ، اختر وحدات البكسل ثم انقر فوق موافق.

لقياس منطقة الفلورسنت ، انقر فوق تحليل ثم القياس. ثم انقر فوق تحليل وإظهار النتائج. ستظهر نافذة النتائج وسيكون قياس مساحة الفلورسنت تحت العنوان المسمى المنطقة.

بمجرد تسجيل جميع القياسات ، قم بحساب متوسط القيم من ثلاثة إلى ستة أقسام لكل. استخدم اختبارا إحصائيا مناسبا لمقارنة المناطق المنقولة بين المجموعات. تظهر هذه الصورة التمثيلية التألق المناعي GFP في مخيخ الفئران ، بعد أربعة أسابيع من حقن وريد الذيل ل AAV 9 GFP.

تم استخدام برنامج تحليل الصور لتسليط الضوء بشكل انتقائي على منطقة الفلورسنت وتحديد وحدات البكسل المميزة. هذه هي صورة GFP من غير محول. يكتشف تحليل هذه الصورة ، باستخدام نفس المعلمات للحيوان المحقون GFP ، مستوى منخفضا جدا من إشارة الخلفية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الحقن في حوالي خمس دقائق لكل فأر. في الختام ، تصف هذه التقنية طريقة لإدخال الجينات بكفاءة إلى الجهاز العصبي المركزي للفئران ، وينتج عن توصيل الجينات لمرة واحدة تعبيرا دائما وتأثيرات طويلة المدى. الأهم من ذلك ، يتم التلاعب بالجهاز العصبي المركزي من المحيط.

حقن ناقلات وريدية غير جراحية نسبيا ، يصل إلى الدماغ والحبل الشوكي ، الجهاز العصبي المركزي.