طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

الهدف العام من عملية نقل الجينات بواسطة ناقل الفيروس المرتبط بالغدية (adeno-associated virus) هو التلاعب الجيني في دماغ ونخاع الجرذ على نطاق واسع وشامل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال نقل الجينات، وهي وسيلة فعالة للغاية لإدخال الجينات داخل الجسم (in-vivo)، وبالتالي فهي تقنية قوية جدًا ومتعددة الاستخدامات.

يتميز هذا الإجراء بالسرعة والقابلية العالية للتكرار. لقد استخدمنا منهج نقل الجينات واسع النطاق هذا للتعبير عن بروتين مرتبط بالتصلب الجانبي الضموري في جميع أنحاء الحبل الشوكي للجرذان في عدة منشورات. وسيقوم زميلي، Robert Dayton، بشرح هذا الإجراء.

ستقوم Mychal Grames بمساعدة Robert. ابدأ بتجهيز محطة العمل، أولاً، قم بتنظيف السطح بـ 70% ethanol. ثم ضع وسادة تسخين في منطقة العمل واضبطها على درجة حرارة 37 degree celsius.

ضع وسادة سطح المختبر فوق وسادة التسخين. تحقق من توفر كمية كافية من الأكسجين والـ isoflurane اللازمين للإجراء. قم بتنظيف غرفة التحريض وقناع التخدير باستخدام ethanol بتركيز 70%، ثم ضع قناع التخدير على وسادة سطح المختبر.

تأكد من توفر المستلزمات التالية: مربع واحد من فيلم البارافين بحجم 5 × 5 سنتيمترات تقريبًا لكل حيوان، ووسادة تحضير كحولية واحدة ووسادتان أو ثلاث من الشاش لكل حيوان، ورؤوس ماصات وماصة دقيقة. بعد ذلك، قم بإذابة الناقل في درجة حرارة الغرفة وقم بتمييز أنبوب طرد مركزي دقيق معقم لكل حيوان. اسحب الحجم المطلوب من AAV بالماصة وضعه في الأنبوب المناسب، ثم أكمل الحجم حتى يصل إلى حجم الحقن المطلوب باستخدام محلول رينجر اللاكتات أو المحلول الملحي.

بعد عملية الرج الدوامي للعينة لمدة ثانية أو ثانيتين، قم بإجراء طرد مركزي نبضي لمدة خمس ثوانٍ لترسيب العينة في قاع الأنبوب. اسحب إجمالي حجم الحقن من الأنبوب ووضعه على مربع من فيلم البارافين. بعد ذلك، قم بتركيب إبرة قياس 30 على حقنة سعة 1 ml.

ضع الإبرة بحيث تكون الفتحة المائلة متجهة للأسفل داخل الناقل الموجود على فيلم البارافين. اسحب مكبس المحقنة للخلف حتى ينتقل كل الفيروس إلى الإبرة والمحقنة. قم بتخدير الجرذ بشكل صحيح باستخدام نظام التخدير.

تأكد من الوصول إلى مستوى تخدير كافٍ من خلال غياب الاستجابة لقرصة إصبع القدم. بعد ذلك، ضع الجرذ في منطقة العمل على جانبه وحافظ على التخدير باستخدام القمع الأنفي. ومع استلقاء الجرذ على جانبه، يجب أن يكون أحد أوردة الذيل الجانبية متجهًا للأعلى.

يتم الحقن عند ثلثي طول الذيل. امسح موقع الحقن باستخدام مسحة كحولية. أمسك الذيل بإحكام أعلى منطقة الحقن قليلاً، مع وضع إصبع واحد مباشرة فوق الوريد الجانبي للذيل، مما سيؤدي إلى توسيع الوريد.

مع توجيه الشطب للأعلى، قم بمحاذاة الإبرة مع الوريد الذي يظهر في الذيل في نفس الاتجاه. اخترق الجلد فوق الوريد الذي في الذيل، مع توخي الحذر الشديد لتجنب إصابة اليد الأخرى التي تمسك بالذيل وتضغط على الوريد. خفف الضغط عن وريد الذيل للسماح بتدفق الدم بشكل طبيعي.

بعد ذلك، قم بإدخال الإبرة في الوريد. وللتأكد من أن الإبرة قد اخترقت وريد الذيل، اسحب المكبس للخلف قليلاً؛ فإذا كانت الإبرة داخل الوريد، سيتدفق الدم إلى داخلها.

بعد إعادة ضبط موضع الإبرة إذا لزم الأمر، قم بتثبيت الإبرة عن طريق إسناد طرف المحقنة مقابل الذيل. احقن الناقل ببطء في الذيل بمعدل 20 microliters تقريباً في الثانية. في حالة الحقن غير المتقن، سيحدث تحول جيني جزئي فقط للحيوان، ومن المرجح ألا تكون النتائج مفيدة.

ومع ذلك، ومع الممارسة، تصبح عمليات الحقن الجيدة قابلة للتكرار وموثوقة للغاية. بعد إعطاء الناقل، اسحب الإبرة من الذيل واضغط بقطعة شاش على موقع الحقن للمساعدة في وقف النزيف لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية. ثم أوقف تخدير الإيزوفلوران والأكسجين.

راقب الجرذ حتى يستعيد وعيه ثم أعِده إلى قفصه. تخلص من المواد التي قد تكون ملوثة بـ AAV في حاوية مناسبة للمخاطر البيولوجية وقم بتنظيف محطة العمل باستخدام 70% ethanol. احصل على مقاطع إكليلية بسمك 50 micron من الدماغ المثبت والمحمي بالتجميد لحيوان محقون بـ AAV، وذلك باستخدام ميكروتوم انزلاقي ذو منصة تجميد.

بعد إجراء الصبغ المناعي لبروتين GFP وتثبيت العينات على الشرائح، التقط صوراً مجهرية لكل مقطع في المنطقة المحددة ذات الأهمية باستخدام عدسة ذات تكبير منخفض بواسطة المجهر. حافظ على ثبات إعدادات الكاميرا عبر جميع العينات المراد تحليلها، واحفظ البيانات كملفات بصيغة TIFF. افتح الصور المجهرية باستخدام برنامج Scion Image المتاح على نطاق واسع.

ستفتح نافذتان، أغلق النافذة المشار إليها باسم index color. اختر options، ثم density slice. سيتم تحديد نطاق من الظلال باللون الأحمر في نافذة look up table.

في النافذة، استخدم المؤشر لتحديد مناطق وسم GFP النوعية فقط، وتوقف عندما تبدأ الخلفية غير النوعية في الظهور في الصورة. بعد ذلك، انقر فوق "تحليل" (analyze) ثم "ضبط المقياس" (set scale). يجب أن يشير السطر الرابع إلى الوحدات (units)، ومن القائمة المنسدلة، اختر "بكسل" (pixels) ثم انقر فوق "موافق" (okay).

لقياس المساحة الفلورية، انقر على analyze ثم measure. بعد ذلك، انقر على analyze و show results. ستظهر نافذة النتائج وستجد قياس المساحة الفلورية تحت العنوان المسمى area.

بمجرد تسجيل جميع القياسات، قم بحساب متوسط القيم من ثلاثة إلى ستة مقاطع لكل حيوان. استخدم اختباراً إحصائياً مناسباً لمقارنة المناطق التي تم نقل الجين إليها بين المجموعات. تُظهر هذه الصورة التمثيلية التألق المناعي لـ GFP في مخيخ الجرذ، بعد أربعة أسابيع من الحقن في وريد الذيل بـ AAV 9 GFP.

استُخدم برنامج لتحليل الصور لتسليط الضوء بشكل انتقائي على المنطقة الفلورية ولقياس عدد البكسلات المحددة. هذه هي صورة GFP لحيوان غير مُحوّل جينياً. ويكشف تحليل هذه الصورة، باستخدام نفس المعايير المستخدمة للحيوان الذي حُقن بـ GFP، عن مستوى منخفض جداً من إشارة الخلفية.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إتمام عملية الحقن في غضون خمس دقائق تقريبًا لكل جرذ. وختاماً، تصف هذه التقنية وسيلة فعالة لإدخال الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي للجرذ، حيث يؤدي نقل الجينات لمرة واحدة إلى تعبير جيني مستمر وتأثيرات طويلة الأمد. والأهم من ذلك، يتم التحكم في الجهاز العصبي المركزي من خلال المحيط.

يصل حقن الناقل الوريدي، وهو إجراء غير باضع نسبيًا، إلى الدماغ والنخاع الشوكي، أي الجهاز العصبي المركزي (CNS).