عالية الدقة ذوبان ير ل تكمل مستقبلات 1 طول تعدد الأشكال التنميط الجيني: أداة مبتكرة لمرض الزهايمر الجينات تقييم القابلية

الهدف العام من هذه الطريقة هو النمط الجيني لتعدد الأشكال بطول مستقبلات تكملة 1 لاستخدامها في تقييم القابلية للإصابة بالأمراض ، مثل مرض الزهايمر ، لفهم دور الأشكال الإسوية CR1 في التسبب في المرض بشكل أفضل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل التسبب في مرض الزهايمر. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها لا تتطلب عينات دم جديدة وهي أسهل وأرخص وأسرع وبالتالي قابلة للتطبيق على عدد أكبر من السكان.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما ندرك التحديات في إجراء البقع الغربية فيما يتعلق بالوقت اللازم والحاجة إلى عينات دم جديدة. ماصة 20 ميكرولتر من البروتيناز K في قاع أنبوب سعة 1.5 مل. ثم أضف 200 ميكرولتر من العينة إلى الأنبوب.

أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى العينة. تخلط عن طريق دوامة النبض لمدة 15 ثانية. بعد الخلط ، احتضن على حرارة 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي.

بالطرد المركزي لفترة وجيزة لأنبوب 1.5 مليلتر لإزالة القطرات من داخل الغطاء. ثم أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول إلى العينة. امزج مرة أخرى عن طريق النبض لمدة 15 ثانية قبل الطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة كما كان من قبل.

بعد ذلك ، ضع الخليط بعناية على عمود الغشاء في أنبوب تجميع سعة ملليلتر. دون ترطيب الحافة ، أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 6 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ضع عمود الغشاء في أنبوب تجميع نظيف سعة ملليلتر وتخلص من الأنبوب الذي يحتوي على المرشح.

افتح عمود الغشاء بعناية وأضف 500 ميكرولتر من عازلة الغسيل دون ترطيب الحافة. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 6,000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، ضع عمود الغشاء في أنبوب تجميع نظيف سعة ملليلتر وتخلص من الأنبوب الذي يحتوي على المرشح.

بعد فتح عمود الغشاء بعناية ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المخزن المؤقت اثنين دون ترطيب الحافة. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 20،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، ضع عمود الغشاء في أنبوب تجميع جديد سعة ملليلتر وجهاز طرد مركزي مرة أخرى.

بعد الطرد المركزي ، ضع عمود الغشاء في أنبوب نظيف سعة 1.5 مليلتر وتخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على المرشح. افتح عمود الغشاء بعناية وأضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر. احتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي عند 6 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

لتنفيذ بروتوكول HRM-PCR ، قم أولا بتخفيف عينات الحمض النووي في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر بالماء إلى تركيز 10 نانوجرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف المحاليل الأولية المذابة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر بالماء إلى نفس تركيز ستة ميكرومولار. قم بإذابة حلول مجموعة HRM-PCR واخلطها بعناية عن طريق الدوامة لضمان استعادة جميع المحتويات.

بتدوير القوارير الثلاث التي تحتوي على خليط إنزيمي مع صبغة ربط الحمض النووي وكلوريد المغنيسيوم والماء لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق قبل فتحها. في أنبوب سعة 1.5 مليلتر في درجة حرارة الغرفة ، استخدم المكونات لتحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتفاعل 120 ميكرولتر كما هو موضح في بروتوكول النص. تخلط بعناية عن طريق الدوامة.

من الأهمية بمكان أن تعمل باهتمام وتطبيق وفقا للممارسات الجيدة في البيولوجيا الجزيئية. ماصة 19 ميكرولترا من تفاعل البوليميراز المتسلسل تمزج في كل بئر من صفيحة بيضاء متعددة الآبار. أضف ميكرولتر واحدا من قالب الحمض النووي المعدل بالتركيز ، ثم أغلق الصفيحة البيضاء متعددة الآبار بورق مانع للتسرب.

جهاز الطرد المركزي للوحة بيضاء متعددة الآبار لمدة دقيقة واحدة عند 1 ، 500 مرة G في جهاز طرد مركزي قياسي دلو متأرجح يحتوي على دوار لألواح متعددة الآبار مع محولات مناسبة. قم بتحميل اللوحة البيضاء متعددة الآبار في أداة HRM-PCR. ابدأ برنامج HRM-PCR بشروط PCR الموجودة في بروتوكول النص.

بعد تفاعل HRM-PCR ، قم بإجراء تحليل إدارة الموارد البشرية لتحديد تعدد الأشكال بطول CR1 كما هو موضح في بروتوكول النص. تم تحليل منحنيات الاندماج باستخدام البرنامج بعد الذوبان عالي الدقة للأمبليكونات المشتقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل من الحمض النووي الجيني لأشخاص ذوي أشكال إسوية مختلفة من CR1. النتائج عبارة عن منحنيات تميز الموضوعات وفقا لأنماطها الظاهرية لتعبير CR1 النمطية.

كما هو موضح في طريقتي العرض ، منحنيات الذوبان الطبيعية والمتغيرة ومخطط الفرق الطبيعي والمتحول بدرجة الحرارة ، يتم توزيع ملامح المنحنى وفقا للنجمة CR1 الثلاثة ، ونجمة CR1 مجموعة واحدة ، ونجمة CR1 واحدة ، ونجمة CR1 مجموعة مزدوجة ، ونجمة CR1 مجموعة واحدة ، ونجمة CR1 مجموعة واحدة ، ونجمة CR1 مجموعة مزدوجة ، ونجمة CR1 نجمة ثنائية ، CR1 نجمة المجموعة الرابعة. تتوافق هذه المنحنيات مع أليلات تعدد الأشكال بطول CR1. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التنميط الجيني بسهولة لتعدد الأشكال بطول CR1 وفقا للمنحنيات المثالية التي تم الحصول عليها بواسطة HRM-PCR.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الحاجة إلى عينات مرجعية من الأنماط الجينية المعروفة بالفعل بطول CR1. عند إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام نفس التركيز لكل عينة من الحمض النووي.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي المخروطي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العثور على SNP خاص جديد معروف. بعد هذا التطور ، تمهد هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال علم الوراثة السكانية لاستكشاف الضغط الانتقائي لمسببات الأمراض في تعدد الأشكال بطول CR1. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لقابلية التسبب في مرض الزهايمر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات أخرى للأمراض مثل الذئبة الحمامية الجهازية والملاريا.