النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

الهدف العام من هذه الطريقة هو تصنيع ببتيدات أميلويد بيتا 42 وحقنها في دماغ الزرد البالغ ، لتوليد نموذج معين من جرعات الأميلويد كما هو موضح في مرض الزهايمر. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في معالجة أسئلة مهمة في مجال علم الأعصاب ، مثل تأثير سمية الأميلويد على الخلايا الجذعية العصبية ، وكيف يمكننا استنباط استجابة التجديد في مثل هذه الظروف الضارة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي تقريرها ، وهي قابلة للتكرار والأنماط الظاهرية التي نحصل عليها تذكرنا إلى حد كبير بمرض الزهايمر في أدمغة البشر.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مرض الزهايمر لأنها توفر نموذجا طبيعيا للفقاريات ، وهو قادر على تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في حالة المرض ، لذلك يمكن لأسماك الزرد أن تعلمنا كيفية التعافي من التنكس العصبي. لتحضير ببتيد الأميلويد بيتا 42 ، قم بتحميل مركب الببتيد الآلي ب 500 ملليغرام من الراتنج المحمي FMOC كمرحلة صلبة. ثم قم بتحميل 0.5 مولار من الأحماض الأمينية المحمية FMOC في الحجم المطلوب ، كما هو محسوب للمركب المعني.

استخدم ثنائي ميثيل فورماميد DMF لإذابة HBTU النشط بتركيز 0.48 مولار. ثم أضف 45٪ حجم لكل حجم n ميثيل مورفولين أو NMM ، القاعدة و 5٪ حجم لكل حجم ، أنهيدريد حمضي ، خليط السد ، في DMF. قم بتحميل الكواشف المحضرة في المركب وقم بتشغيل المركب الآلي لتخليق الطور الصلب للببتيد.

بعد الانتهاء من دورات تخليق الببتيد على المركب ، قم بشق الببتيدات ، عن طريق نقل الراتنج إلى أنبوب تفاعل وإضافة 10 مل من خليط الانقسام الطازج ، والذي يتكون مما يلي. ثم امزج باستمرار الدعامة الصلبة في خليط الانقسام لمدة أربع ساعات ، لشق الببتيدات عن الدعامة الصلبة. قم بترسيب المنتج المشقوق عن طريق إضافة خليط الانقسام إلى 100 مل من ثنائي إيثيل الأثير المثلج.

مرر المحلول من خلال وحدة ترشيح تحتوي على مرشح PTFE بحجم مسام 0.45 ميكرومتر. بعد ذلك ، اجمع الببتيد المصفى من ورق الترشيح. وإذابة 100 ملليغرام من الببتيد المترسب في 5 ملليلتر من محلول 1: 1 من الأسيتونيتريل ، وتقطير الماء منزوع الأيونات ، والدوامة لإذابة الببتيد الخام.

ثم لتنقية الببتيد ، عبر قاعدة عكسية HPLC ، قم بإعداد شبه محضر من HPLC ، ومجهز بعمود من البوليسترين ديفينيل بنزين مسامي بحجم 10 ميكرومتر. سخن العمود باستخدام وحدة تسخين العمود ، للحفاظ على العمود عند 50 درجة مئوية. قم بتطبيق الببتيد على العمود واجمع جميع الكسور الرئيسية باستخدام مجمع الكسور الآلي.

عن طريق تطبيق تدرج من 5٪ إلى 100٪ أكريلونيتريل بمعدل أربعة ملليلتر في الدقيقة على مدار 25 دقيقة. راقب الكروماتوجرام عند 220 نانومتر ، واجمع القمم المناسبة وحلل النتائج باستخدام LCMS. يتم نقل الكسور الرئيسية التي تم جمعها إلى قوارير العينة وتحميلها على جهاز LCMS لإجراء فحص تحليلي.

تتم مراقبة العينات باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية ، أثناء تمرير العينة عبر عمود فريق CA التحليلي بحجم البنجر 1.7 ميكرومتر. يتم تحديد الكسور الصحيحة عن طريق قياس الطيف الكتلي. قم بتجميد الكسور الصحيحة من الببتيد المطلوب إلى مسحوق رقيق ، في قارورة سفلية مستديرة ، عن طريق تطبيق فراغ 0.052 ملليبار.

قم بإقران مضخة التفريغ بوحدة تجميد ، يتم الحفاظ عليها عند 78 درجة مئوية تحت الصفر. ثم قم بتخزين المسحوق المجفف إلى أجل غير مسمى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم الببتيد المجفف بالتجميد لتحضير محلول مخزون واحد مليمولار من خليط 1: 2: 1 من الأسيتونيتريل ، DMF.

ومياه من الدرجة التحليلية للتجارب. للحقن ، قم بإعداد خليط 20 ميكرومولار في PBS. وقم بتخزين المحلول على الثلج حتى الحقن.

استخدم مجتذب إبرة مع المعلمات الموضحة في بروتوكول النص ، لإعداد الشعيرات الدموية لحقن الزجاج. اضبط إعداد الضغط على مصدر الضغط على 25 رطل لكل بوصة مربعة. ثم في الحاقن الصغير ، اضبط ضغط التثبيت على 20 رطل لكل بوصة مربعة ، وضغط الإخراج على 10 رطل لكل بوصة مربعة ، وقيمة الفترة على 2.5 وقيمة النفي إلى 100 مللي ثانية.

بعد ذلك ، قم بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول الحقن. ثم أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في حامل الحقن المجهري ، واضبط زاوية الحقن على 45 درجة. ضع سمكة واحدة في طبق بتري جديد مليء بمحلول التخدير.

بمجرد تخديرها ، امسك السمكة بالملقط ووجهها للحقن. باستخدام طرف إبرة قياس 30 ، قم بإنشاء شق في الجمجمة فوق التكتوم البصري ، حيث تلتقي الصفيحتان الجانبيتان. استخدم طرف الإبرة فقط ولا تخترق أكثر من ملليمتر واحد عبر الجمجمة.

ثم مع الاستمرار في حمل السمكة ، أدخل طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من خلال موقع الإدخال. قم بتوجيه طرف الشعيرات الدموية الزجاجية باتجاه telencephalon بزاوية 45 درجة. ثم حقن ميكرولتر واحد من المحلول.

ضع السمكة مرة أخرى في وعاء النقل حتى تتعافى. ثم قم بتوصيل الحاوية بمياه السمك المتداولة بانتظام ، لضمان جودة المياه المثلى. بعد التضحية بالأسماك ، وفقا لبروتوكول النص ، اقطع الجمجمة فوق التكتوم البصري على الجانب الظهري باستخدام ملقط مدبب.

ثم استخدم مشرطا لتشريح الرأس خلف الزعنفة الصدرية مباشرة. ضع الرؤوس في ثلاثة ملليلتر من 2٪ PFA. واحتضان الأنسجة عند 4٪ مئوية بين عشية وضحاها.

للحماية الخلوية وإزالة الكلس ، اغسل الرؤوس ثلاث مرات في محلول فوسفات 0.1 مولار ، درجة الحموضة 7.4 ، ثم انقلها إلى 20٪ سكروز ، 20٪ محلول EDTA. واحتضان عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم انقل الرؤوس إلى 7.5٪ جيلاتين ، 20٪ محلول سكروز في قوالب الأنسجة البلاستيكية.

وقم بتجميدها على الثلج الجاف. استخدم ناظم البرد لتقسيم الرؤوس إلى عمليات بالتبريد بسمك 12 ميكرومتر. ثم انقل المقاطع البردية مباشرة إلى شرائح زجاجية وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام على المدى الطويل.

لتلطيخ الشرائح ، جفف الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الذوبان ، اغسل الأقسام مرتين في PBS ، ومرة واحدة في PBS باستخدام 0.3٪ Triton X-100 يسمى PBSTx. أضف الجسم المضاد الأساسي إلى الشرائح.

واحتضان العينات عند 4٪ مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام PBS ومرتين باستخدام PBSTx. ثم أضف إلى الأقسام الجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلورة جنبا إلى جنب مع DAPI و PBSTx.

واحتضان الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ثلاث مرات من الغسيل في PBSTx ، استخدم 100 ميكرولتر من 70٪ من الجلسرين وزلة غطاء لتركيب كل شريحة. أخيرا ، احصل على صور الفلورسنت باستخدام مجهر متحد البؤر.

لتحديد الببتيد المركب بشكل صحيح ، تم إجراء تحليل التحليل الطيفي الكتلي على جميع الكسور المنقاة HPLC لببتيدات الأميلويد بيتا 42 الأصلية و CPP الموسومة ببتيدات أميلويد بيتا 42. تمت معالجة جزء HPLC ، الذي أسفر عن ذروة واحدة على UPLC ، أي نسبة الشحنة الرئيسية الصحيحة لببتيد بيتا الأميلويد المطلوب لمزيد من المعالجة للتجارب.

بعد الحقن المجهري الدماغي البطيني ، تتجمع الببتيدات في الدماغ وتشكل ترسب الأميلويد كما ترى العناقيد الخضراء. ينظر إلى هذه المجاميع في الغالب على أنها ترسبات داخل الخلايا ، ولكن أيضا حول الأوعية الدموية. هذه التجمعات هي مؤشرات على التراكم الناجح لببتيدات الأميلويد والأنسجة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الحقن في بضع دقائق. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراقبة صحة وسلوكه عن كثب. بعد أن طورنا هذه التقنية ، ساعدتنا في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بمرض الزهايمر ، مثل علم الأمراض ، واستجابة الخلايا الجذعية العصبية في دماغ الزرد.