تحديد الأحماض السياليك في الكبد وعينات الحليب من البرية من نوع و

الهدف العام من هذه المنهجية هو الكشف عن حمض N-Acetylneuraminic وحمض N-Glycolylneuraminic في كبد وحليب الفئران من النوع البري والفئران التي تم تعطيل جين CMAH فيها باستخدام تحليل HPLC. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات في مجال علم السكريات، وتحديداً تأثير الأنماط الجينية لنماذج فئران CMAH على المحتويات الفعلية لحمض السياليك في هذه الحيوانات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالفحوصات الجينية هي إمكانية تحديد مستويات حمض السياليك النسبية للفئران متغايرة الزيجوت أيضاً.

سيتولى تقييم هذه الطريقة كل من Cui Cao وWang Wenjiao، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا من مختبرنا. ابدأ هذا الإجراء بجمع حليب الفئران وأنسجة كبد الفئران من الفئران التي تعاني من تعطيل جين CMAH كما هو موضح في البروتوكول النصي. لعزل أحماض السياليك من الحليب، انقل 50 µL من الحليب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 mL، وأضف 1.2 mL من محلول حمض الخليك المائي المُحضّر.

لعزل أحماض السياليك من أنسجة الكبد، قم بإذابة 20 إلى 50 milligram من كبد الفأر برفق وانقلها إلى مطحنة أنسجة dounce. أضف 1.2 milliliters من محلول حمض الأسيتيك المائي وقم بتجانس الأنسجة عن طريق القص اللطيف لمدة 10 ثوانٍ. انقل المعلق الناتج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter.

بعد ذلك، يتم تحضين الحليب المحمض أو معلق الأنسجة لمدة أربع ساعات عند 80 درجة مئوية. ثم، يتم طرد العينة مركزياً عند 14,000 ×g لمدة 10 دقائق. انقُل 1000 µL من الطبقة العليا للسائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 mL.

أزل المذيب عن طريق التبخير المركزي في درجة حرارة الغرفة حتى يجف تماماً. أعد إذابة العينة في 500 µL من الماء المقطر. بعد ذلك، قم بتجهيز عمود تبادل أنيوني دقيق عن طريق نقل 200 mg من راتنج التبادل الأنيوني لكل عينة إلى أنابيب فارغة سعة 3 mL مزودة بصنبور إغلاق.

أضف 2 milliliters من محلول حمض الأسيتيك المائي لاستبدال أيونات الكلوريد في الراتنج بأيون الأسيتات. أغلق الصنبور بمجرد وصول المذيب إلى أعلى الراتنج. أضف 2 milliliters من الماء المقطر برفق ثم افتح الصنبور.

أوقف التدفق بمجرد وصول معظم المذيب إلى أعلى الراتنج. تأكد من أن الراتنج مغطى دائمًا بالمذيب. بعد ذلك، اغسل عمود الراتنج مرتين إضافيتين باستخدام 2 mL من الماء المقطر لإزالة خلات الزائد.

انقل 500 microliters الناتجة من مادة مذيب العينة إلى عمود الراتنج وتخلص من السائل المتدفق. اغسل الراتنج برفق باستخدام 2 milliliters من الماء المقطر. استخلص أنيونات العينة من الراتنج باستخدام 1 milliliter من محلول أسيتات الأمونيوم بتركيز 50 millimolar في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter.

قم بإزالة المذيب عن طريق التبخير بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة حتى الجفاف. زن ما بين 5 و 8 ملليغرام من حمض N-Acetylneuraminic باستخدام ميزان تحليلي في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. سجل الوزن الدقيق وأضف 164 ميكرولتر من الماء المقطر لكل ملليغرام.

احصل على حمض N-Glycolylneuraminic بكميات صغيرة وسعر متوسط، مثل حصص بسعة 1 milligram. أضف 154 µL من الماء المقطر مباشرة إلى المركب لتحضير محلول مخزون بتركيز 20 mM تقريباً من Neu5Gc. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 mL.

يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة 20- درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهراً. اخلط 5 µL من كل محلول مخزون في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 mL. بعد ذلك، قم بإزالة المذيب عن طريق التبخير بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة حتى الجفاف.

أضف 20 µL من محلول OPD إلى عينات حمض السياليك المستخلصة من حليب الفأر، أو كبد الفأر، أو المعيار المختلط لحمض السياليك. قم برج العينة بقوة باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، حضّن العينات لمدة أربع ساعات عند 80 °C في الظلام.

بعد ترك العينات لتبرد لمدة خمس دقائق، أضف 80 µL من الماء المقطر. ثم، قم بطرد مركزي للأنابيب بسرعة 14,000 ×g لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، انقل 80 µL من supernatant إلى قارورة HPLC ذات استعادة عالية سعة 300 µL.

يمكن تخزين عينات حمض السياليك المشتقة في درجة حرارة تتراوح بين أربع إلى ست درجات Celsius لمدة تصل إلى أسبوع واحد. يتم تحليل العينات باستخدام نظام HPLC قياسي متصل بكاشف فلورسنس عبر الإنترنت. استخدم عمود C18 من الطور المعكوس بطول 250 millimeter وقطر 4.6 millimeter لإجراء التحليل.

بعد تحضير المذيب A والمذيب B، وضبط تشغيل جهاز HPLC كما هو مفصل في البروتوكول، قم بحقن 50 µL من العينة في نظام HPLC. راقب المادة الشطفة باستخدام كاشف الفلورية عند طول موجي للإثارة يبلغ 373 nm وطول موجي للانبعاث يبلغ 448 nm. وأخيرًا، احسب الكمية النسبية لـ Neu5Gc كما هو موضح في البروتوكول النصي.

تظهر هنا كروماتوغرامات HPLC ممثلة لأحماض السياليك الموسومة بالفلورسنت من عينات حليب، مشتقة من فئران CMAH ذات تعطيل جيني متماثلة الزيجوت وفئران CMAH ذات تعطيل جيني متباينة الزيجوت. كما تظهر أيضاً الفئران من النوع البري. وبالمثل، تظهر هنا كروماتوغرامات أحماض السياليك الموسومة بالفلورسنت المشتقة من كبد الفأر.

تُظهر مقارنة الكميات النسبية من Neu5Gc أن الفئران ذات التعطيل الجيني المتماثل لـ CMAH لا تحتوي على Neu5Gc، بينما تحتوي الفئران ذات التعطيل الجيني المتباين لـ CMAH والفئران البرية على نسبة تتراوح بين 10% و 75% من Neu5Gc. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن تحضير العينات في غضون ثماني ساعات إذا تم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح، ويمكن تحليل العينات بواسطة جهاز HPLC ذاتي السحب طوال الليل.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء عملية عزل حمض السياليك وعملية الاشتقاق في اليوم نفسه. وبعد الانتهاء من الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل مطياف الكتلة من أجل تأكيد طبيعة الإشارات الفلورية التي تم الحصول عليها. ويتيح تطوير هذه التقنية للباحثين استكشاف توزيع حمض السياليك في العينات البيولوجية.

لا تنسَ أن العمل مع حمض الأسيتيك المركز وحمض الفورميك يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.