تحليل مشيه الحركية الطائرة السهمي في الفئران C57BL/6 تعرض إلى MOG35-55 التي يسببها التجريبية النخاع المناعة الذاتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الضعف الحركي الوظيفي في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أو EAE ، التصلب المتعدد لنموذج الفأر باستخدام تحليل المشي الحركي. تم تحديد تطبيق تحليل المشي الحركي على سلوك المشي بالفأر ووصفه سابقا من قبل الآخرين. ينتج العجز العصبي في EAE عن الالتهاب العصبي وفقدان المادة البيضاء المتقطع في جميع أنحاء الحبل الشوكي والمخيخ.

تقليديا ، تم تقييم الاستقرار الحركي في الفئران EAE باستخدام أنظمة التسجيل السريرية ، حيث يتم تعيين درجة سريرية للفئران بناء على انطباع المراقب عن شدة العجز الحركي. البيانات من الدرجات السريرية ترتيبية ولا ترتبط بشكل جيد بأمراض الحبل الشوكي. لقد ثبت مؤخرا أن تحليل المشي الحركي هو ارتباط سلوكي أفضل لفقدان المادة البيضاء من الدرجات السريرية ، بالإضافة إلى تقديم وصف موضوعي لعجز المشي في فئران EAE.

تتضمن هذه التقنية وضع علامات عاكسة على الأطراف العالية للفئران والسماح لها بالسير على جهاز المشي أثناء تسجيلها بكاميرا عالية السرعة. ثم يتم استخراج المعلمات الحركية من الفيديو باستخدام برنامج تحليل الحركة. الخطوة الأولى هي عمل العلامات التي سيتم وضعها على الساق الخلفية للحيوان.

انعكاس الضوء من هذه العلامات باستخراج إحداثيات النقاط التشريحية على الساق من مقاطع الفيديو. للبدء ، قم بضرب العدد المطلوب من الدوائر من ورقة العاكسة. يتطلب كل ماوس خمس علامات لكل تسجيل ، اثنتان كبيرتان وثلاث علامات صغيرة.

باستخدام مقص ناعم ، قم بعمل قطع يمتد من المحيط إلى مركز الدائرة. انزع دعامة الورق للكشف عن السطح اللاصق باستخدام ملقط دقيق. أمسك العلامة بالملقط وباستخدام إصبعك ، قم بلف العلامة على نفسها لتشكيل مخروط.

لعمل علامة صغيرة ، قم بعمل قطع أطول وقم بلف المخروط بإحكام أكبر. لعمل علامة كبيرة ، قم بعمل قطع أقصر وقم بلف المخروط بشكل أكثر فضفاضة. باستخدام مسدس الغراء الساخن ، املأ الجزء الداخلي من المخروط بالغراء وألصقه بقطعة من الورق المقوى.

من المهم ملء العلامة بالكامل بالغراء لمنع العلامة من الانهيار عند التعامل معها أثناء التسجيل. بمجرد أن يجف الغراء ، اقطع العلامة باستخدام مشرط. تأكد من الابتعاد عن جسمك.

الخطوة التالية هي إعداد للتسجيل. للقيام بذلك ، يجب لصق العلامات العاكسة على الطرف الخلفي للفأر في المواقع التشريحية المناسبة. يتم إجراء ذلك تحت التخدير الخفيف.

ضع الفأر في غرفة الحث وقم بتخديره بنسبة 2.5٪ إيزوفلوران. بمجرد أن تفقد الوعي ، انقل الماوس من غرفة الحث إلى مخروط الأنف أو وسادة تسخين المياه المعاد تدويرها. ضع مادة تشحيم موضعية على كلتا العينين.

حلق الطرف الخلفي المطلوب الممتد من الكاحل إلى العمود الفقري وأسفل الأضلاع. في هذا العرض التوضيحي ، نقوم بإعادة ترميز حركات الطرف الخلفي الأيمن ، ولكن يمكن استخدام أي من الطرفين أو كليهما. حدد موقع القمة الحرقفية عن طريق جمع كلتا الركبتين معا مع الإبهام والسبابة والجس أسفل الأضلاع مباشرة.

ضع علامة على هذا الموقع باستخدام علامة دائمة. حدد موقع الورك عن طريق تمديد الساق وتحريكها ذهابا وإيابا. ضع علامة على مفصل الورك ، وهي نقطة المفصل بين رأس عظم الفخذ والحوض.

باستخدام مسطرة مرنة ، قم بقياس وتسجيل طول الساق أو ساق الفأر. قم بقياس وتسجيل طول عظم الفخذ أو الفخذ أيضا. لعزل إصبع القدم الرابع لوضع العلامة ، قم بلصق بقية القدم.

أمسك بعلامة صغيرة بالملقط واغمس الطرف المسطح في الغراء. ضع العلامة الصغيرة على طرف إصبع القدم الرابع. ضع علامة صغيرة أخرى على مفصل مشط القدم.

ضع آخر قلم تحديد صغير على الكاحل. ضع علامة كبيرة على مفصل الورك مباشرة فوق العلامة الموجودة على الجلد. ضع العلامة الكبيرة الثانية على العلامة فوق القمة الحرقفية.

قم بإزالة الشريط من القدم. ضع الماوس في قفص الاسترداد وانقله على الفور إلى غرفة تسجيل المشي. الخطوة التالية هي تسجيل الماوس وهو يمشي على جهاز المشي.

هذه الصورة لإعداد تسجيل جهاز المشي الخاص بنا ، وتظهر الضوء والكاميرا عالية السرعة وجهاز المشي. قبل تسجيل مشية الماوس ، التقط صورة لكتلة معايرة بأبعاد معروفة على جهاز المشي. سيسمح ذلك بتحويل وحدات البكسل الموجودة في الفيديو إلى قياسات حقيقية.

من الأهمية بمكان أن تظل زاوية الكاميرا وموضعها اللذين يتم عندها التقاط صورة المعايرة كما هيهما أثناء تسجيل سلوك المشي. ضع الماوس في جهاز المشي. قم بزيادة سرعة جهاز المشي تدريجيا لتوجيه الماوس في الاتجاه الصحيح.

تسارع ببطء إلى 20 سم في الثانية ، وهي سرعة الجري المثالية للحصول على تسجيلات المشي الثابت. للحصول على تحليل دقيق ، من الأفضل تسجيل ثماني إلى 12 دورة من سلوك المشي الثابت. هذا مثال على المشي المتسق.

فيما يلي نفس الفيديو المعروض بنصف السرعة. نظرا لأن الفئران تمشي بسرعة كبيرة ، فقد يكون من المفيد عرض مقاطع الفيديو بسرعات أبطأ لحساب دورات الخطوات وتقدير نمط المشي بشكل أفضل. هذا مثال واحد على فأر EAE يمشي على جهاز المشي.

هذا الفأر غير قادر على تحمل وزن جسمه لأن حوضه منخفض جدا على الأرض. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يواجه صعوبة في رفع قدمه عن الأرض أثناء مرحلة التأرجح. هذا مثال على فأر آخر EAE يعاني من عجز حركي أقل حدة.

يمشي فأر EAE على أصابع قدميه مع انخفاض الحركة في مفصل الكاحل. هذا يعطي الفأر مشية غير متساوية. فيما يلي أمثلة على السلوكيات التي من شأنها أن تضاعف التحليل.

يجب عدم استخدام التسجيلات، بما في ذلك هذه السلوكيات. يحدث التأخر عندما يتوقف الفأر عن المشي ويسافر إلى الجزء الخلفي من جهاز المشي ، ولكنه يستأنف المشي بعد ذلك. قد يحدث هذا في أي ماوس ، ولكنه سيحدث بشكل متكرر عند السرعات المنخفضة.

تحدث التربية عندما ينقل الفأر وزنه على أطرافه الخلفية الخلفية ويرفع رأسه والجزء العلوي من جسمه. هذا السلوك شائع في الفئران القلقة. فيما يلي أمثلة على الإضاءة السيئة التي ستؤدي إلى مشكلات في تحليل موقع العلامات في الزمان والمكان.

إذا كانت الإضاءة خافتة جدا ، فقد لا تعكس العلامات ضوءا كافيا ليتم التعرف عليها بواسطة برنامج الكمبيوتر. في هذا الفيديو ، لا يمكن رؤية علامات إصبع القدم بسهولة بسبب عدم كفاية الإضاءة. إذا كانت الإضاءة ساطعة جدا ، فقد تعكس الأشياء الأخرى غير العلامات الكثير من الضوء ويمكن التعرف عليها كعلامة.

في هذا الفيديو ، يبدو أن علامات إصبع القدم تندمج مع الأجزاء العاكسة من جهاز المشي. يمكن استخدام البيانات من العلامات العاكسة على الفئران التي تمشي لإنشاء نماذج عصا للساق يمكن من خلالها استخراج المعلمات الحركية. هذا تسجيل لفأر يمشي مع نموذج عصا للساق متراكب.

لاحظ أنه في هذا الفيديو ، توجد علامة سادسة على الركبة ، وهي ليست ضرورية لأن موقع الركبة يمكن تثليثه من مواضع مفاصل الورك والكاحل ، والأطوال المقاسة لعظم الفخذ والساق. نظرا لأن العلامات الموجودة على مفصل الركبة غالبا ما تكون غير دقيقة بسبب انزلاق الجلد ، فإن التثليث هو الطريقة المفضلة. يمكن تقسيم دورة خطوة الماوس إلى مرحلتين رئيسيتين.

مرحلة الموقف ومرحلة التأرجح. يمكن استخدام مخطط العصا هذا لتوضيح حركة الطرف الخلفي في الزمان والمكان. مثال على ذلك يمكن أن يكون تقييم حركة الطرف الخلفي في أوقات مختلفة خلال الدراسة.

يوضح هذا المثال أن الساق الخلفية مضغوطة أثناء مرحلة الوقوف ، مما يشير إلى أن الفأر يواجه صعوبة في دعم وزن جسمه. وينعكس هذا من خلال زيادة ثني مفاصل الركبة والكاحل. في وقت لاحق ، تعافى هذا جزئيا.

هذا الفيديو العلاقة بين سلوك المشي وزوايا المفاصل بمرور الوقت. يمكن استخراج أشكال موجات زاوية الورك والركبة والكاحل من كل تسجيل. يمكن بعد ذلك حساب متوسط زوايا المفصل على مدى ثماني إلى 12 دورة متتالية ، مما ينتج عنه متوسط دورة خطوة يمكن استخدامها لمزيد من التحليل.

يمثل هذا الرسم البياني شكل موجة مفصل الركبة بمتوسط 10 دورات متتالية. تم تطبيع البيانات ، بحيث يكون طول مرحلتي الموقف والتأرجح 100 إطار على التوالي. تمثل الخلفية الواضحة مرحلة التأرجح وتمثل الخلفية الخضراء مرحلة الوقف.

بالنسبة لهذا الفأر ، كان سلوك المشي من أسبوع لآخر متسقا للغاية وتداخلت أشكال موجات دورة الخطوة من كل أسبوع بشكل كبير. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هناك أيضا تباين كبير في المشية في الفئران السليمة كما هو موضح في هذا الرسم البياني. درجة التباين الموضحة هنا مقبولة وضمن نطاق ما يمكن توقعه من الماوس.

يمثل هذا الرسم البياني دورة خطوة الركبة من فأر EAE المسجلة في ثلاثة أسابيع متتالية. هناك تغيير طفيف في شكل دورة الخطوة في الأسبوع الثاني وانحراف كبير بحلول الأسبوع الثالث ، حيث تكون ركبة الفأر أكثر ثنينا ولا تمتد أثناء المشي. هناك العديد من المعلمات التي يمكن قياسها باستخدام هذه التقنية.

سنصف بإيجاز ثلاثة. يتم الحصول على متوسط الزاوية عن طريق حساب متوسط جميع الزوايا طوال دورة الخطوة الطبيعية. في هذه الحالة ، ينخفض متوسط الزاوية طوال الدراسة ، مما يشير إلى أن الفئران لا تمد ركبتها بقدر المعتاد.

يتم الحصول على نطاق الحركة عن طريق طرح أصغر زاوية من أكبر زاوية في دورة الخطوة الطبيعية. يمكن أن تمنحك هذه المعلمة نظرة ثاقبة لمرونة المفاصل أو صلابتها أو ضعفها. في هذا المثال ، ينخفض نطاق حركة الركبة طوال الدراسة مما يشير إلى أن الفئران غير قادرة على تحريك ركبتها بشكل طبيعي ، ربما بسبب ضعف العضلات.

فرق الجذر والمتوسط المربع هو طريقة تستخدم لقياس انحراف أشكال موجات دورة الخطوة عن تسجيل خط الأساس. تخبرك هذه المعلمة بمقدار الانحراف عن التسجيل الأولي. تحليل المشي الحركي هو تقنية قيمة يمكن استخدامها لاكتشاف ووصف التغيرات في المشي بحساسية.

قد يكون تطبيق تحليل المشي الحركي على دراسات EAE أداة قيمة في فهم العواقب الوظيفية لأمراض الحبل الشوكي في هذا النموذج. قد يسهل اكتشاف علاجات جديدة للتصلب المتعدد. بالإضافة إلى ذلك ، لا يقتصر تحليل المشي الحركي على سياق EAE.

تم استخدام هذه التقنية سابقا في نماذج الفئران المصابة بإصابة الحبل الشوكي ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض هنتنغتون والسكتة الدماغية ، ويمكن تطبيقها على نماذج الفئران الأخرى المصابة باضطرابات عصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون.