زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

يتمثل الهدف العام من تقنية التجاوز (leapfrogging) في تسهيل إنشاء سلالات طافرة للجينات الأساسية في عملية التخلق الجنيني. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محورية في علم الوراثة التنموي وغيرها من المجالات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الحصول على طفرات في الجينات الأساسية في الجيل الأول F1.

لبدء هذا الإجراء، يتم الحقن المجهري لأجنة Xenopus في مرحلة الخلية الواحدة باستخدام معقدات Cas9-sgRNA كما هو موضح في البروتوكول النصي. عندما تصل الأجنة إلى 4.5 ساعة بعد الإخصاب، في مرحلة البلاستولا المبكرة التاسعة، يتم إخراجها من الحاضنة عند درجة حرارة 25 درجة Celsius للسماح لها بمواصلة النمو في درجة حرارة الغرفة. لبدء عملية الزرع عند خمس ساعات بعد الإخصاب، استخدم ماصة باستور لنقل جنين واحد غير محقون إلى طبق أغاروز بقطر 60 مليمتر يحتوي على منخفضات، والذي سيعمل كمستقبل للطعم.

انقل أيضاً جنيناً مانحاً لـ PGC إلى الطبق. استخدم الملاقط لإزالة الأغلفة المحية يدوياً من كل جنين. وقم بتدوير كلا الجنينين بحيث تكون أقطابهما النباتية مرئية ومتاحة للجراحة.

بعد ذلك، وأثناء تثبيت الجنين المستقبل باستخدام حلقة الشعر، أدخل الطرف الحاد لسكين شعر الحاجب في القطب النباتي، أسفل السطح مباشرة. وبحركات تقطيع سريعة إلى الأعلى، اصنع أربعة شقوق ضحلة على شكل مربع، داخل المنطقة التي ستتشكل فيها مستقبلاً الخلايا الزجاجية التي تحدد سدادة الجنين. وبمجرد تحديد أضلاع المربع الأربعة، استخدم سكين شعر الحاجب لتعميق كل شق باستخدام حركات قطع مماثلة إلى عمق يتراوح تقريباً بين 1/3 إلى 1/2 المسافة إلى أرضية التجويف الأرومي.

حرر قطعة النسيج الخضري من الجنين المستقبل عن طريق إجراء قطع أفقي واحد أو أكثر في المنطقة الخضرية العميقة. بعد ذلك، وبسرعة، كرر هذا الإجراء على الجنين المانح للخلايا الجرثومية الأولية (PGCs) لإنشاء قطعة نسيج خضري ذات حجم مماثل للنقل. وبمجرد إزالة النسيج الذي يحتوي على PGCs من الجنين المانح، استخدم سكين شعر الحاجب وحلقة الشعر لوضع القطعة المزروعة في الفتحة التي تم إنشاؤها في الجنين المستقبل.

استخدم ساق سكين شعر الحاجب، مع إمساكها بشكل موازٍ لسطح الطعم، للضغط بلطف على الطعم داخل الفتحة الموجودة في السطح النباتي للجنين المستقبل. استخدم حلقة الشعر لسحب جثة الجنين المانح برفق فوق سطح الأجاروز وإدخالها في بئر. تأكد من أن الجرح المفتوح في الجثة يواجه السائل الرئيسي.

قم بإزاحة الجنين المستقبل إلى بئر مجاورة، وتأكد بالمثل من أن نسيج القطب النباتي المطعّم يواجه السائل الرئيسي. كرر عملية نقل الخلايا الجرثومية الأولية (PGCs) باستخدام أجنة إضافية لإنشاء المزيد من أزواج الهياكل المنقولة، حتى تصل الأجنة إلى المرحلة 10 تقريبًا (مرحلة بداية gastrula)، مع نقل الأجنة إلى آبار فارغة أثناء إجراء عمليات النقل. بمجرد أن تلتئم الطعوم في مكانها، وعادة ما يكون ذلك بعد 30 إلى 45 دقيقة من عملية النقل، استخدم ماصة باستور لنقل الأجنة برفق شديد من المنخفضات إلى آبار فردية في طبق مكون من 24 بئرًا ومغطى بالأجاروز.

قم بتدوير الأجنة بحيث يكون القطب النباتي للأعلى، مواجهاً للمحلول الرئيسي. ضع جثث الجهات المانحة والمستقبلات المطعّمة في آبار متجاورة للمساعدة في تتبع أزواج الأجنة وسجل هذه المعلومات. بعد ذلك، انقل الطبق المكون من 24 بئراً والذي يحتوي على الأجنة إلى حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم نقل كل مستقبل للطعم، والذي يكون الآن في مرحلة برعم الذيل المبكرة، إلى بئر فردية في طبق سداسي الآبار جديد ومغطى بالأجاروز. يتم تربية الأجنة التي خضعت لعملية القفز الجيني (leapfrogged embryos)، ويُجرى تحليل للحمض النووي للمانح المستخلص من الجثث وفقاً لبروتوكول النص. ونظراً لأن القفز الجيني ينتج حيوانات تتميز باستبدال فعال لخطها الجرثومي بأليلات طافرة، فإنه يمكن الحصول على الأنماط الظاهرية الطافرة في الجيل F1.

كما هو موضح في هذا الجدول، أفاد Blitz وزملاؤه أن غالبية حيوانات الجيل F0، التي استهدفت موقع إنزيم التيروزيناز (tyrosinase) المسؤول عن تصبغ الخلايا الميلانينية والشبكية، أظهرت انتقالاً للجراثيم بنسبة 100% للجينومات الطافرة المشتقة من المانح، وذلك وفقاً لما تم قياسه عن طريق التهجين الخارجي مع حيوانات مهق (albino) تفتقر إلى التيروزيناز. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية زراعة الخلايا الجرثومية البدائية في ضفدع Xenopus.