A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة والتحقق من التفاعل بين معقد البروتين غير المتجانس والحمض النووي (DNA) في نظام مغاير لأي دراسة جينومية وظيفية في بيئة مختبرية اعتيادية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الجينوميات الوظيفية، مثل الجينوميات المخطط لها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على الكشف عن تفاعلات البروتين مع الـ DNA التي تشمل أكثر من بروتين واحد أو عامل نسخ واحد.

ابدأ هذا الإجراء في بعد ظهر اليوم الذي سيتم تحديده كاليوم الأول. ابدأ بمستنبت بحجم 5 milliliter في وسط محدد اصطناعي أو وسط SD خالي من اليوراسيل من طبق بتري تم تخطيطه حديثاً. يتم التحضين طوال الليل في هزاز عند درجة حرارة 30 degree Celsius.

في ظهر اليوم التالي، قم بتلقيح 10 milliliters من وسط YPDA بـ 500 microliters من المزرعة التي حُضنت طوال الليل، ثم حضنها طوال الليل في هزاز عند 30 degree Celsius. وفي الصباح الباكر من اليوم التالي، قم بتلقيح 100 milliliters من وسط YPDA بـ 2 milliliters من المزرعة التي حُضنت طوال الليل. اترك هذه المزرعة الحديثة لتنمو عند 30 degrees Celsius حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.4 إلى 0.8.

قم بالطرد المركزي عند 1000 ×g ودرجة حرارة 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من السائل الطافي. أضف 10 ملليلتر من الماء المعقم وأعد تشكيل الراسب عن طريق الرج الدوامي.

قم بالطرد المركزي عند 1000 ×g ودرجة حرارة 21 °C لمدة خمس دقائق. تخلص من الطافي، ثم أضف 2 mL من محلول TE lithium acetate، وأعد تشكيل الراسب عن طريق المزج الدوامي. قم بالطرد المركزي عند 1000 ×g ودرجة حرارة 21 °C لمدة خمس دقائق.

تخلص من الطافي. أضف 4 milliliters من TE lithium acetate بالإضافة إلى 400 microliters من salmon sperm DNA وأعد تعليق الراسب عن طريق السحب والدفع بالماصة. أصبحت الخلايا الآن جاهزة للتحول كما هو موضح في المقطع التالي.

يتم إجراء التحويل المشترك للخلايا في لوحة خلط ذات 96 بئراً وقاع على شكل حرف U. أولاً، يتم توزيع 20 µL من الخلايا المختصة لكل بئر في اللوحة ذات الـ 96 بئراً. ثم تضاف إلى الآبار 150 ng من كل من البلازميدين وعنصر التحكم في التسوية.

يوضح هذا المخطط الترتيب العام للأطباق لعملية التحول المشترك لخلايا الخميرة مع البروتين المستهدف. يمكن تعديل ترتيب الأطباق وفقاً لمتطلبات التجربة وعدد مناطق أو قطع DNA التي يتم اختبارها. أضف 100 µL من TE lithium acetate polyethylene glycol لكل بئر، وامزج المحلول ثلاث مرات باستخدام الماصة.

قم بتغطية الطبق بختم نفاذ للهواء واحضنه عند 30 degrees Celsius لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. ثم قم بإجراء صدمة حرارية عند 42 degrees Celsius لمدة 20 دقيقة بالضبط. بعد الصدمة الحرارية، قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 1000 ×g و 21 degrees Celsius لمدة 5 دقائق.

استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الطافي. أضف 110 µL من TE وامزج. قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق.

قم بإزالة 100 µL من الطافي من كل بئر. اغمر أداة الثقب في إيثانول 100%، ثم قم بتعقيمها باللهب، وانتظر لمدة دقيقة واحدة حتى تبرد دبابيس أداة الثقب، وبعد ذلك استخدم أداة الثقب المعقمة لإعادة تعليق الراسب. انقل الخلايا إلى أطباق آغار SD خالية من التربتوفان والليوسين.

يتم تحضين الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. في بعد ظهر اليوم الخامس، استخرج أطباق auger من المحضنة. املأ كل بئر من طبق خلط sterile 96 well u-bottom بـ 50 µL من TE. قم بترطيب puncher معقم مسبقاً في TE، ثم اقتطع المستعمرات من طبق SD tryptophan and lucine drop out، وأعد تعليقها في الطبق المملوء بـ TE.

انقل المستعمرات إلى أطباق آجار SD جديدة خالية من التربتوفان والليوسين، لضمان التغطية المثلى للسطح. قم بحضن الأطباق عند درجة حرارة 30 °C لمدة يومين. في بعد ظهر اليوم السابع، استخرج أطباق الآجار من الحاضنة.

املأ كل بئر من ألواح خلط معقمة ذات 96 بئرًا وقاع على شكل حرف u بـ 50 µL من وسط SD الخالي من التريبتوفان واللوسين. املأ كل بئر من كتلة آبار عميقة معقمة ذات 96 بئرًا بـ 180 µL من وسط SD الخالي من التريبتوفان واللوسين. قم بتعقيم أداة الثقب، وترطيبها مسبقًا بالوسط، ثم انقل المستعمرات من اللوح إلى الآبار التي تحتوي كل منها على 50 µL من الوسط.

انقل 20 µL من الخميرة إلى 180 µL من وسط SD tryptophan and lucine drop out. أغلق الكتلة بغطاء نفاذ للهواء، ثم حضنها عند درجة حرارة 30 °C مع الرج لمدة 36 ساعة. وفي صباح اليوم التاسع، انقل 100 µL من المزرعة إلى 500 µL من وسط YPDA في كتلة 96 بئراً عميقة ومعقمة.

قم بالتغطية بسدادة نفاذة للهواء، ثم قم بالتحضين عند 30 degrees Celsius مع الرج بسرعة 200 rpm لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات. بعد مرور ثلاث إلى خمس ساعات، أعد تعليق المزرعة وانقل 125 microliters من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 nanometers للتأكد من أنها تتراوح بين 0.3 و 0.6.

قم بطرد الخلايا المتبقية في كتلة الآبار العميقة مركزياً بسرعة 3000 ×g ودرجة حرارة 21 °C لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي عن طريق القلب. أضف 200 µL من Z buffer إلى كل بئر ثم استخدم جهاز المزج الدوامي (vortex).

قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 3000 G و21 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الطافي عن طريق القلب. أضف 21 microliters من Z buffer إلى كل بئر واستخدم جهاز الـ vortex.

غطِّ الطبق برقاقة إغلاق مقاومة لدورات التجميد والإذابة. وفي خزانة سحب الأبخرة، قم بإجراء 4 دورات من التجميد والإذابة باستخدام النيتروجين السائل وحمام مائي عند درجة حرارة 42 درجة مئوية. أضف 200 µL من محلول Z buffer beta mercaptoethanol ONPG المُحضّر حديثاً إلى كل بئر.

يُحضن عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من 17 إلى 24 ساعة أو حتى يظهر اللون. في صباح اليوم العاشر، يتم التحقق من ظهور اللون. يُضاف 110 µL من كربونات الصوديوم بتركيز 1 molar إلى كل بئر لإيقاف التفاعل.

سجل الوقت وقم برج اللوحة باستخدام جهاز هزاز دوامي (vortex). ثم قم بالطرد المركزي عند 3000 ×g و21 °C لمدة عشر دقائق. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 125 µL من السائل العلوي من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي.

قم بقياس الكثافة الضوئية عند 420 نانومتر. احسب نشاط بيتا جالاكتوزيداز في جدول بيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي. في هذه الدراسة، تم تقسيم منطقة المحفز المكونة من 2600 زوج قاعدي في المنبع من بداية موقع بدء النسخ إلى ست مناطق أو قطع.

تعد هذه الصورة مثالاً لطبق نمو جيد وإيجابي بعد اليوم الخامس من البروتوكول. وفي هذه النتيجة التمثيلية، تظهر قطع DNA الأولى والرابعة تفاعلاً إيجابياً مع معقد البروتين A وB. وعند قياس نشاط بيتا جالاكتوزيداز، تظهر القطعة الأولى تحفيزاً لنشاط الجين المراسل بمقدار أربعة أضعاف.

من المهم تذكر أن هذا الإجراء يُوصى به للحصول على معلومات حول مناطق DNA فقط بعد التأكد من التفاعل البروتيني-البروتيني المقترح، وهو ليس مصمماً لتوفير معلومات عن المواقع المستهدفة. وبناءً على هذه الإجراءات، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل مقايسة chip و Msar، للإجابة على أسئلة إضافية؛ على سبيل المثال، تحديد المواقع المستهدفة في الجسم الحي (in vivo).

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية اختبار والتحقق من دور مجمعات البروتينات المتعددة القسيمات التي ترتبط بهدف DNA مشترك.