A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة والتحقق من صحة تفاعل البروتين المركب غير المتجانس مع الحمض النووي في نظام غير متجانس لأي دراسة جينومية وظيفية في بيئة معملية منتظمة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الجينوم الوظيفي ، مثل علم الجينوم المخطط له. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تكتشف تفاعلات الحمض النووي للبروتين التي تتضمن أكثر من بروتين أو عامل نسخ.

ابدأ هذا الإجراء بعد ظهر ما سيتم تعيينه على أنه اليوم الأول. ابدأ مزرعة 5 مل في وسط اصطناعي محدد أو SD بدون يوراسيل من طبق بتري مخطط حديثا. احتضن طوال الليل في شاكر 30 درجة مئوية.

بعد ظهر اليوم التالي ، قم بتلقيح 10 مل من وسط YPDA ب 500 ميكرولتر من المزرعة الليلية واحتضانها طوال الليل في شاكر 30 درجة مئوية. في وقت مبكر من صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 مل من وسط YPDA ب 2 مل من الثقافة الليلية. قم بزراعة هذه الثقافة الطازجة عند 30 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.4 إلى 0.8.

جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية. أضف 10 مل من الماء المعقم وأعد تكوين الحبيبات عن طريق الدوامة.

جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 2 مل من أسيتات الليثيوم TE ، وأعد تكوين الحبيبات عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية. أضف 4 ملليلتر من أسيتات الليثيوم TE بالإضافة إلى 400 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون وأعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. الخلايا جاهزة الآن للتحويل كما هو موضح في الجزء التالي.

يتم إجراء التحويل المشترك للخلايا في لوحة خلط 96 بئر على شكل حرف U. أولا ، قم بتوزيع 20 ميكرولترا من الخلايا المختصة لكل بئر في لوحة البئر 96. ثم أضف إلى الآبار 150 نانوغراما لكل من البلازميدات والتحكم في التطبيع.

يوضح هذا التخطيطي اللوحة العامة التي تم إعدادها للتحول المشترك لخلايا الخميرة مع البروتين ذي الأهمية. يمكن تعديل إعداد اللوحة وفقا لحاجة التجربة وعدد مناطق الحمض النووي أو الأجزاء التي تم اختبارها. أضف 100 ميكرولتر من أسيتات الليثيوم TE والبولي إيثيلين جلايكول لكل بئر واخلطها ثلاث مرات عن طريق سحب العينات.

قم بتغطية الطبق بختم مسامي واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة بالضبط. بعد الصدمة الحرارية ، جهاز الطرد المركزي عند 1000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة المادة الطافية. أضف 110 ميكرولتر من TE واخلطها. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق.

قم بإزالة 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر. اغمر المثقاب في 100٪ من الإيثانول ، وقم بإشعاله ، وانتظر دقيقة واحدة حتى تبرد دبابيس الثقب ، ثم استخدم أداة الثقب المعقمة لإعادة تعليق الحبيبات. نقل الخلايا إلى SD التربتوفان واللوسين إسقاط لوحات اوجير.

احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. بعد ظهر اليوم الخامس ، استرجع لوحات المثقاب من الحاضنة. املأ كل بئر من لوحة الخلط المعقمة 96 بسعة 50 ميكرولتر من TE. قم بتبليل مثقاب معقم في TE ، وقم بثقب المستعمرات من لوحة إسقاط التربتوفان واللوسين SD ، وأعد تعليقها في لوحة TE المملوءة.

انقل المستعمرات إلى ألواح المثقاب الجديدة SD و lucine ، للحصول على تغطية مثالية للسطح. احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. بعد ظهر اليوم 7 ، استرجع لوحات المثقاب من الحاضنة.

املأ كل بئر من معقمة 96 بئر U-أسفل لوحة خلط مع 50 ميكرولتر من SD التربتوفان واللوسين تسرب متوسط. املأ كل بئر من كتلة بئر عميقة معقمة 96 ب 180 ميكرولتر من وسط تسرب التربتوفان واللوسين. قم بتعقيم المثقاب ، وبلل المثقاب والوسط مسبقا ، وانقل المستعمرات من اللوحة إلى الآبار التي تحتوي كل منها على 50 ميكرولترا من المتوسط.

انقل 20 ميكرولترا من الخميرة إلى 180 ميكرولتر من وسط تسرب التربتوفان واللوسين. أغلق الكتلة بختم مسامي ، واحتضن عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 36 ساعة. في صباح اليوم التاسع ، انقل 100 ميكرولتر من المزرعة إلى 500 ميكرولتر من وسط YPDA في كتلة بئر عميقة معقمة 96.

قم بتغطيتها بختم مسامي واحتضانها عند 30 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى خمس ساعات. بعد ثلاث إلى خمس ساعات ، قم بتعليق الثقافة ونقل 125 ميكرولترا من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر للتأكد من أنها تتراوح بين 0.3 و 0.6.

الطرد المركزي للخلايا المتبقية في كتلة البئر العميقة عند 3000 مرة G و 21 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت Z إلى كل بئر ودوامة.

جهاز طرد مركزي عند 3000 جم و 21 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها. أضف 21 ميكرولترا من المخزن المؤقت Z إلى كل بئر ودوامة.

قم بتغطية اللوحة بورق مانع للتسرب مقاوم لدورات الذوبان التجميد. في غطاء الدخان ، قم بإجراء 4 دورات من التجميد / الذوبان باستخدام النيتروجين السائل وحمام مائي 42 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول Z العازلة بيتا ميركابتو إيثانول ONPG المحضر حديثا إلى كل بئر.

احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 17 إلى 24 ساعة أو حتى يتطور اللون. في صباح اليوم 10 ، تأكد من تطور اللون. أضف 110 ميكرولتر من كربونات الصوديوم المولية إلى كل بئر لإيقاف التفاعل.

سجل الوقت ودوامة اللوحة. جهاز طرد مركزي عند 3000 مرة جم و 21 درجة مئوية لمدة عشر دقائق. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 125 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر إلى لوحة مقياس الطيف الضوئي.

قم بقياس الكثافة الضوئية عند 420 نانومتر. احسب نشاط بيتا جالاكتوزيداز في ورقة انتشار كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، تم تقسيم منطقة المروج المكونة من 2600 زوج أساسي في المنبع من بداية موقع بدء النسخ إلى ست مناطق أو أجزاء.

هذه الصورة هي مثال على لوحة جيدة النمو وإيجابية بعد اليوم الخامس من البروتوكول. في هذه النتيجة التمثيلية ، تظهر شظايا الحمض النووي الأول والرابع تفاعلا إيجابيا مع مركب البروتين A و B. عند قياس نشاط بيتا جولاكتيسيداز ، يظهر الجزء الأول تحريضا رباعي لنشاط جين المراسل.

المهم أن تتذكر أن هذا الإجراء موصى به للحصول على معلومات عن مناطق الحمض النووي فقط بعد تأكيد تفاعل بروتين البروتين المقترح وليس مصمما لتوفير معلومات عن المواقع المستهدفة. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إعداد طرق أخرى ، مثل مقايسة الرقاقة و Msar من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال ، تحديد المواقع المستهدفة في الجسم الحي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار والتحقق من صحة دور مجمعات البروتين متعدد الأشكال المرتبطة بهدف الحمض النووي المشترك.