الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

الهدف العام لهذه المنهجية هو الزراعة المشتركة للورم ثلاثي الأبعاد من خلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية لتقييمها الأيضي ، باستخدام محلل التدفق خارج الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول تأثيرات الورم الفطري على التمثيل الغذائي للخلايا وحساسية الدواء. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في أنها سريعة وسهلة نسبيا وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، ويمكن تكييفها بسهولة مع حالات أخرى من محاذاة الخلايا.

وسيكون عرض الإجراء باوان نويل وروبن مونوز. باستخدام تقنية زراعة الأنسجة المعقمة القياسية ، قم بزراعة الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ذات الأهمية في قوارير T75 في وسط النمو المناسب. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ ، اغسل الثقافات مرة واحدة ، في خمسة ملليلتر من PBS وافصل الخلايا عن أسطح القارورة ، باستخدام ملليلترين من 0.05٪ تريبسين EDTA لكل قارورة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد التأكد من الانفصال تحت المجهر ، قم بإلغاء تنشيط التربسين بثمانية ملليلتر من وسط النمو لكل قارورة ، وقم بماصة الخلايا عدة مرات ، لتوليد معلقات خلية واحدة للعد. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في 1 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيزات مليلتر في وسط النمو الطازج. لمغنطة الخلايا ، أضف 10 ميكرولتر من المكوك النانوي في وسط النمو ، و 100 ميكرولتر من الخلايا وقم بتحريك المحاليل برفق.

اقلب الأنابيب برفق عدة مرات وانقل خلطات المكوك النانوي للخلية إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئرا. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع اهتزاز لطيف ، لتسهيل ارتباط المكوك النانوي بسطح الخلية. في نهاية حضانة الربط ، امزج برفق كل معلق خلية ممغنط مع سحب العينة واضبط التركيز على 1.5 × 10 إلى الخلايا السرطانية الممغنطة الرابعة أو الخلايا الليفية لكل 150 ميكرولتر من الوسط.

امزج الخلايا الليفية والخلايا السرطانية بنسبة اثنين إلى واحد ، ليصبح المجموع 150 ميكرولترا من الخلايا المصنفة لكل بئر. ضع لوحة طارد الخلايا 96 جيدا فوق محرك كروي مغناطيسي 96 بئر مع مغناطيس أرق وبذرة 150 ميكرولتر من خليط الخلايا في كل بئر. عندما يتم طلاء جميع الخلايا ، احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، مع استمرار توصيل محرك الكرة المغناطيسية.

في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة المحرك المغناطيسي وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة تصل إلى سبعة أيام أخرى. في اليوم السابق لمقايسة التمثيل الغذائي ، قم بترطيب خرطوشة المسبار ب 200 ميكرولتر من عيار الفحص لكل بئر في لوحة المرافق المتوفرة واحتضان لوحة المرافق طوال الليل ، في حاضنة مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي ، راقب الكرويات في صفيحة النمو تحت المجهر الضوئي ، للتحقق من مورفولوجيتها وتوحيدها العام.

انقل لوحة النمو إلى محرك مغناطيسي واستنشق بعناية ما يقرب من 120 ميكرولتر من وسط النمو لكل بئر. اغسل الكرويات برفق باستخدام 120 ميكرولتر من وسط الفحص الدافئ ثلاث مرات. بعد الغسيل الأخير ، افحص الكرويات تحت المجهر مرة أخرى للتأكد من أن الكرات الكروية لم يتم غسلها وأضف 180 ميكرولترا من وسط الفحص الدافئ إلى كل بئر.

استخدم طرفا عريضا لشفط كرة واحدة مغسولة مسبقا بعناية من لوحة النمو الطاردة للخلية ونقل الكروية برفق مباشرة إلى وسط بئر واحد من لوحة الفحص الكروية ، مما يسمح للكروية بالسقوط في الغرفة الدقيقة المركزية للبئر عن طريق الجاذبية. عندما يتم نقل جميع الكرات ، ضع لوحة الفحص في حاضنة الهواء المرطبة غير CO2 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة ، قم بتوجيه خرطوشة المستشعر بحيث تكون الصفوف من A إلى H على الجانب الأيسر وضع دليل تحميل أعلى الخرطوشة ، بحيث يكون الحرف المقابل للمنفذ المراد تحميله ، في الزاوية اليسرى العليا.

إذا تم تحميل اللوحة بالتساوي ، فافتح برنامج التحليل وانقر فوق القوالب. انقر نقرا مزدوجا فوق القالب الفارغ وانقر فوق إنشاء مجموعات. ضمن علامة تبويب خريطة اللوحة ، قم بتعيين مجموعات للوحة الفحص ، المقابلة للتصميم التجريبي وحدد آبار الزوايا الأربعة كآبار الخلفية.

ضمن علامة تبويب بروتوكول الجهاز ، تحقق من دورة المعايرة والتوازن وخط الأساس. انقر فوق الحقن وحدد المركب لكل منفذ. قم بتغيير دورات القياس إلى ستة، وراجع البروتوكول وملخص المجموعة، ثم احفظ قالب تصميم المقايسة.

استنادا إلى تصميم الفحص كدليل، استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع كل كاشف مباشرة في منافذ الحقن، مع تثبيت موجهات التحميل في مكانها بأطراف الأصابع. عندما يتم تحميل جميع الكواشف ، قم بإزالة دليل التحميل وأمسك الخرطوشة على مستوى العين لفحص منافذ الحقن بصريا للتحميل المتساوي. انقل الخرطوشة الموجودة في لوحة المرافق إلى محلل التدفق خارج الخلية وابدأ معايرة الفحص المسبق.

بمجرد المعايرة ، استبدل لوحة المرافق بلوحة الفحص الدافئة مسبقا التي تحتوي على الأكرويات ثلاثية الأبعاد وابدأ المقايس. عند الانتهاء من الفحص ، قم بتصدير البيانات إلى برنامج تحليل البيانات المناسب. في تجربة نموذجية ، يزداد قطر الكرويات من حوالي 400 ميكرومتر في اليوم الثاني إلى ما يقرب من 600 ميكرومتر في اليوم السابع ، بعد الطباعة ، مع عدم ملاحظة أي زيادة كبيرة بعد اليوم السابع.

تظهر جميع الأنواع الثلاثة من المزارع الكروية استجابة وظيفية بيولوجيا لمقايسة إجهاد تحلل السكر استجابة لحقن تركيز مشبع من الجلوكوز كما يتضح من زيادة معدلات تأكيدها خارج الخلية. بشكل عام ، قد تعزى إشارة معدل تأكيد أعلى خارج الخلية من الكرات الكروية المشتقة من الخلايا السرطانية ، مقارنة بالإشارة من الخلايا الليفية الأصغر نسبيا من الخلايا الليفية PS1 ، إلى الميل الأيضي المتأصل نحو تحلل السكر في الخلايا السرطانية. في اختبار إجهاد الميتوكوندريا التمثيلي هذا للسرطانات الليفية الورمية ، لوحظ انخفاض في تنفس الميتوكوندريا استجابة لمثبط سينسيز ATP ، المرتبط بجزء تنفس الميتوكوندريا المستخدم في إنتاج ATP الخلوي.

الحقنة الثانية بعامل فصل ، حفزت الحد الأقصى لاستهلاك الأكسجين للكرويات مع الزيادة المقابلة في تنفس الميتوكوندريا. حقنة ثالثة من مثبطات سلسلة نقل الإلكترون الأولى وثلاثة ، تنفس الميتوكوندريا المحظورة لوحظ على أنه انخفاض حاد في معدل استهلاك الأكسجين. يمكن استخدام هذه المعلمات ومعدلات التنفس القاعدي لحساب تسرب البروتون وقدرات الجهاز التنفسي الاحتياطية للكرويات ، مما يوفر تحليلا استقلابيا متعدد المعلمات للمركبات الممغنطة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات ، إذا تم التخطيط لها جيدا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ترطيب المسبار في حاضنة 37 درجة قبل أربع إلى 16 ساعة من إجراء فحص التمثيل الغذائي. بعد إجراء الاستزراع الكروي ، يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل تجارب الاستجابة للجرعة للإجابة على أسئلة إضافية حول فعالية الدواء والسمية والمواد المخترقة والقابلية للإصابة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان البنكرياس لاستكشاف تفاعلات سدى الورم داخل البيئة المكروية للورم في نموذج ثلاثي الأبعاد يحاكي بيولوجيا الورم في الجسم الحي وخصائصه. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الكرويات ثلاثية الأبعاد ، بدءا من ورم البنكرياس المزروع وخلايا الخلايا الليفية إلى التحليل النهائي لوظائف التمثيل الغذائي الخلوية.