التنميط المضادة لل Neu5Gc مفتش في المصل البشري مع سيالوغليكان ميكروأري الفحص

الهدف العام من اختبار المصفوفات الدقيقة sialoglycan هو تقييم Anti-Neu5Gc IgG في الأمصال البشرية بطريقة عالية الإنتاجية مقابل مجموعة متنوعة من sialoglycans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة السكرية ، مثل كيفية مشاركة الأجسام المضادة ل Neu-5Gc في العديد من الأمراض البشرية بما في ذلك السرطان وأمراض القلب وزرع الأجانب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتنميط عالي الإنتاجية للأجسام المضادة ل Neu-5Gc ضد عدد لا يحصى من مستضدات السيالوغليكان.

ستظهر الإجراء شارون يهودا ، طالبة ماجستير من مختبري. يعد التخطيط الدقيق والمفصل لتصنيع المصفوفة وتخطيطها أمرا مهما لضمان النجاح. هذه العملية مفصلة في بروتوكول النص والمعلومات التكميلية.

قم بتخفيف كل جليكان إلى 100 ميكرومولار بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر من مخزن طباعة الجليكان في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد الأمين الأساسي الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت إلى ملليغرام واحد لكل ملليمتر مع عازلة علامة. ثم خفف إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في حجم إجمالي مليلتر واحد.

قم بإعداد تخفيفات منحنى IgG القياسية البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع طبق البئر 384 على الثلج. باستخدام ماصة إلكترونية متعددة ، قم بنقل سبعة ميكرولترات من كل جليكان وعلامة ومنحنى نجمي IgG وفقا لتخطيط اللوحة الموجود في بروتوكول النص.

غطي الطبق بالبارافيلم وقم بتدويره لمدة دقيقتين عند 250 مرة جم و 12 درجة مئوية. يجب أن تتم الطباعة في منطقة خالية من الغبار برطوبة تتراوح من 60 إلى 70٪ هنا ، يتم تنفيذ جميع الخطوات في غرفة نظيفة مع قفازات وملابس مناسبة للحماية. قم بتشغيل آلة طابعة النانو والمرطب.

بعد برمجة آلة الطباعة كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضع لوحة البئر 384 مع عينات مقتبسة في موقعها على سطح المصفوفة وقم بإزالة غطاء البارافيلم. في هذه المرحلة ، ابدأ الطباعة. قم بترقيم الشرائح بقلم تعليم مقاوم للمذيبات الكحولية ، وقم بتخزينها في صندوق مغلق بالفراغ في الظلام.

لمعالجة المصفوفات ، قم أولا بإزالة شريحة من الصندوق المغلق بالفراغ وضعها في غطاء كيميائي لمدة خمس دقائق ، مع توجيه المصفوفة لأعلى ، لتبخير السائل الزائد. بعد ذلك ، قم بترطيب الشريحة عن طريق وضعها في أنبوب تلطيخ مملوء بالماء منزوع الأيونات. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضانه لمدة خمس دقائق مع رج بطيء ولطيف في درجة حرارة الغرفة.

لمنع مجموعات الايبوكسي التفاعلية على الشريحة ، اغمس الشريحة في أنبوب تلطيخ سعة 50 مليلتر مملوء بمحلول حجب الإيثانول أمين الدافئ مسبقا. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضانه لمدة 30 دقيقة مع رج بطيء ولطيف في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول حجب الإيثانول أمين في وعاء القمامة الحيوي المناسب.

بعد ذلك ، ضع الشريحة في أنبوب تلطيخ جديد ونظيف مملوء بالماء منزوع الأيونات بدرجة حرارة 50 درجة مئوية. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضانه لمدة 10 دقائق مع رج بطيء ولطيف في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الماء وانقل الشرائح إلى حامل تلطيخ زجاجي.

ضع الجهاز في حامل لوحة متأرجحة وقم بالطرد المركزي للشريحة حتى تجف. بعد ذلك ، ضع الشريحة على مقسم مكون من 16 بئرا. بعد ترطيب الآبار مسبقا ، استخدم ماصة متعددة لنقل 200 ميكرولتر من PBST في الآبار المنزلقة.

ثم ضعيها في غرفة مغطاة ورطبة ورجيها لمدة خمس دقائق. قم بإزالة PBST عن طريق النقر برفق على منشفة ورقية نظيفة. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من PBS-Ovalbumine الذي يحجب المخزن المؤقت في كل بئر.

ضع الشرائح في غرفة رطبة واحتضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد ذلك ، قم بإعداد الكشف الأساسي ، المخفف في المخزن المؤقت لحجب PBS-OVA كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بنقر PBS-OVA على منع المخزن المؤقت من الشريحة وإضافة 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي لكل بئر.

احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتمرير الاكتشاف الأساسي من الشريحة واغسله ثلاث مرات باستخدام PBST. احتضن الشريحة في PBST لمدة خمس دقائق في غرفة رطبة قبل غسل المرة الأخيرة باستخدام PBST.

ثم اغسل مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي في PBS كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتمرير PBS من الشريحة وأضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي.

بتحريك الجسم المضاد الثانوي من الشريحة واغسله أربع مرات باستخدام PBST كما كان من قبل. قم بإزالة الإطار بعناية ، ثم ضع الشرائح في أنبوب تلطيخ منزلق سعة 50 مليلتر مملوء ب PBS ورجه لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، املأ حمامين تلطيخ منزلقين بالماء منزوع الأيونات.

ضع الشريحة في حامل الشريحة واغمس الشريحة في الحمام الأول. اغمس الشريحة بسرعة عشر مرات. ثم انقل الشريحة إلى الحمام الثاني واغمسها عشر مرات أخرى.

بعد الغمس ، احتضان الشريحة لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج. بعد الحضانة ، تخلص من الماء وانقل الشريحة إلى حامل تلطيخ زجاجي. ضع حامل تلطيخ الزجاج في حامل لوحة متأرجحة وقم بالطرد المركزي للشريحة حتى تجف.

افتح باب الماسحة الضوئية وضع الشريحة بالداخل ، بحيث تكون المصفوفة متجهة لأسفل. في هذه المرحلة ، ابدأ المسح. احفظ الشرائح الممسوحة ضوئيا كملف TIFF.

لإعداد شريحة للتحليل ، حدد تحميل قائمة المصفوفة "وقم بتحميل ملف GAL المناسب الذي يعين المصفوفات في كل كتلة على الشريحة. تم تطوير الشرائح مع 16 شقا مختلفا للكشف الأولي ، واحد في كل كتلة. يربط نبات Lectin SNA بحمض السياليك المرتبط ب a2-6.

في حين أن نبات الليكتين MALII يربط a2-3 حمض السياليك المرتبط. يربط Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY sialoglycans المحتوية على Neu5Gc ولكنه لا يربط sialoglycans المحتوية على Neu5Ac. لتوصيف Anti-Neu5Gc IgG ، تم تحليل 12 مصلا من متبرعين بشريين أصحاء على المصفوفة الدقيقة المطبوعة sialoglycan وتم تطويرها باستخدام IgG المضاد للإنسان المسمى بالفلورسنت في تطويته إلى نانوجرام لكل ميكرولتر.

احتوت جميع الأمصال البشرية التي تم اختبارها على مستويات مختلفة من Anti-Neu5Gc IgG مع عدم وجود أي اعتراف تقريبا بالأزواج المتطابقة من السيالوغليكان المحتوية على Neu5Ac. علاوة على ذلك ، فإن أنماط التعرف على Anti-Neu5Gc IgG متنوعة بشكل كبير بين هذه الأمصال ال 12 المختلفة ، سواء من حيث مستوى الشدة أو التنوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الأجسام المضادة ل Neu-5Gc في عينات بشرية مختلفة بطريقة عالية الإنتاجية ، باستخدام نظام المصفوفة الدقيقة glycan.