استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير إجراء بسيط وفعال للتلوين السلبي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لعينات فيروسية داخل مناطق الاحتواء البيولوجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الفيروسات حول مورفولوجيا وبنية الفيروسات قيد البحث. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تعاملاً سهلاً وفعالاً مع شبكات المجهر الإلكتروني داخل بيئات الاحتواء البيولوجي. كما تُعد هذه التقنية مفيدة كجزء من تشخيص الفيروسات المجهولة بواسطة TEM لأنها يمكن تطبيقها بسهولة على العينات الفيروسية في جميع البيئات. وبالرغم من أننا استخدمنا هذه الطريقة بشكل أساسي للمساعدة في دراسات TEM للفيروسات، إلا أن لها تطبيقات أوسع بكثير ويمكن استخدامها في فحوصات المجهر الإلكتروني لمعظم الجسيمات النانوية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الأمر يتطلب بعض التدريب لضمان عدم تلف شبكات TEM عند تحميلها وتفريغها من الكبسولات.

لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما واجهنا مشكلات في التعامل مع شبكات المجهر الإلكتروني (EM) الصغيرة داخل مناطق الاحتواء البيولوجي.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير أو شراء شبكات نحاسية للمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) مطلية بالكربون والـ Formvar. ضع شبكات TEM المطلية داخل كبسولات. بعد ذلك، انقل الكبسولات المحملة مع المستلزمات والكواشف الأخرى إلى منطقة الاحتواء البيولوجي. للبدء، قم بتثبيت الكبسولة في ماصة. اسحب 40 µL من معلق الفيروس داخل الكبسولة. ضع الماصة على جانبها، بحيث تكون الشبكات موجهة أفقيًا لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ارفع الماصة وفرغ محلول الفيروس في حاوية النفايات. اسحب 40 µL من مثبت الغلوتارالدهيد بتركيز 2% داخل الكبسولات. ضع الماصة على جانبها لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بتفريغ المثبت واسحب 40 µL من الماء منزوع الأيونات داخل الكبسولة، لغسل المثبت. كرر عملية الغسل هذه ثلاث مرات.

بعد ذلك، اسحب 40 µL من إما أسيتات اليورانيل بتركيز 1% أو حمض الفوسفوتونغستيك للبوتاسيوم بتركيز 1% داخل الكبسولة. اترك الكبسولة لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالة الكبسولة من الماصة.

لامس قطعة من ورق الترشيح بحافة الشبكات لتجفيفها. انقل ورق الترشيح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliters. بعد ذلك، اغمر ورق الترشيح في محلول osmium tetroxide بتركيز 1%.

ضع الكبسولة ذات الغطاء المفتوح داخل الأنبوب. أحكم إغلاق الأنبوب لمدة ساعة واحدة للسماح بالتغلغل الكامل لبخار رابع أكسيد الأوزميوم. بعد ذلك، قم بتطهير الأنبوب وانقله من منطقة الاحتواء البيولوجي إلى مرفق المجهر الإلكتروني (EM) من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL-2).

قم بإزالة الكبسولة من أنبوب جهاز الطرد المركزي، ثم ضعها على الماصة. اسحب 40 µL من الماء منزوع الأيونات إلى داخل الكبسولة، ثم فرغ الماء في حاوية النفايات. كرر عملية الغسل بالماء هذه ثلاث مرات.

بعد ذلك، قم بإزالة الكبسولة من الماصة. وباستخدام ورق ترشيح، جفف الشبكات عن طريق التربيت. اترك الشبكات لتجف في الهواء ثم خزنها في صندوق شبكات، حتى يحين وقت إجراء التصوير المجهري الإلكتروني النافذ TEM.

للبدء، اخلط معلق الفيروس بحجم مساوٍ من glutaraldehyde بتركيز 4%، للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2% من glutaraldehyde. وباستخدام المثبت، قم بتعطيل الفيروس لمدة 24 ساعة على الأقل. قم بتطهير الأنبوب ونقله إلى مرفق EM من المستوى BLS-2. بعد ذلك، قم بتثبيت وحدة التقاط محملة بالشبكات على الماصة. اسحب الخليط إلى الكبسولة. ضع الماصة على جانبها بحيث تكون الشبكات موجهة أفقيًا لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، أمسك الماصة وفرغ خليط الفيروس في حاوية النفايات. اسحب 40 microliters من الماء منزوع الأيونات داخل الكبسولة، ثم تخلص من الماء في حاوية النفايات. كرر عملية الغسل هذه ثلاث مرات.

بعد ذلك، اسحب 40 µL من إما 1% UA أو 1% PTA داخل الكبسولة لمدة 30 ثانية. أخرج الكبسولة من الماصة. وباستخدام ورق ترشيح، جفف الشبكات عن طريق التربيت.

بعد ذلك، اترك الشبكات لتجف في الهواء.

في هذه الدراسة، تخضع عينات فيروس إيبولا زائير (Zaire Ebola virus) لعملية الصبغ السلبي، باستخدام كل من طريقة القطرة اليدوية وطريقة الكبسولة. وتظهر صور المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) الناتجة عن هاتين الطريقتين تفاصيل محددة بوضوح، مع وجود هياكل القفيصة النووية في مركز الفيريون وبروتينات سكرية مرئية على السطح. وبالتالي، فإن طريقة الكبسولة قادرة على إنتاج صور TEM بجودة مماثلة لتلك التي تنتجها طريقة القطرة اليدوية. بعد ذلك، تتم مقارنة طرق مختلفة لتعطيل العينات باستخدام فيروس شيكونغونيا (Chikungunya virus). ويتم تحقيق تعطيل العينة إما بشكل سريع، باستخدام 2% glutaraldehyde لمدة 20 دقيقة مع التعرض اللاحق لـ 1% osmium tetroxide لمدة ساعة واحدة، أو طوال الليل، باستخدام 2% glutaraldehyde لمدة 24 ساعة. وكما يتضح، فإن عملية التعطيل الأطول بدون osmium tetroxide تسمح برؤية المزيد من التفاصيل البنيوية الدقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام طريقة الكبسولة، تمت مقارنة صبغتين باستخدام جسيمات شبيهة بالفيروسات مثبتة بالألديهيد. وقد أظهر كل من خلات اليورانيل وحمض الفوسفوتنجستيك نتائج عالية الجودة، مع حدود محددة بوضوح وبروتينات سكرية مرئية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة ونصف تقريبًا، وذلك اعتمادًا على عدد العينات. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار المثبت وكواشف الصبغ المناسبة لأهدافك التجريبية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عد الجسيمات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية عن طريق حساب تركيزات الفيروس.

تعمل هذه التقنية على تحسين الطريقة التي يمكن من خلالها لعلماء الفيروسات استكشاف معلومات مورفولوجيا الفيروسات وبنيتها بسهولة أكبر، خاصة في الفيروسات من مستويي BLS-3 و 4. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل بسهولة مع شبكات TEM للتلوين السلبي داخل مرافق الاحتواء البيولوجي. لا تنسَ أن العمل بمواد مثل الألدهيد، ورابع أكسيد الأوزميوم، وأسيتات اليورانيل يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وغطاء fume hood الكيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.