استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير إجراء تلطيخ سلبي TEM بسيط وفعال للعينات الفيروسية داخل الاحتواء الحيوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الفيروسات حول مورفولوجيا وهياكل الفيروسات التي يتم التحقيق فيها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر معالجة سهلة وفعالة لشبكات المجهر الإلكتروني داخل بيئات الاحتواء الحيوي.

تستخدم هذه التقنية كجزء من تشخيص TEM لفيروس غير معروف لأنه يمكن تطبيقه بسهولة على العينات الفيروسية في جميع البيئات. على الرغم من أننا استخدمنا هذه الطريقة بشكل أساسي للمساعدة في دراسات TEM للفيروس ، إلا أن لها تطبيقا أوسع بكثير ويمكن استخدامها في التحقيق في EM لمعظم الجسيمات النانوية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب بعض الممارسة لضمان عدم تلف شبكات TEM عند تحميلها وتفريغها من الكبسولات.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نواجه مشاكل في التعامل مع شبكات EM الصغيرة في الاحتواء الحيوي. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد أو شراء شبكات نحاسية TEM من الفيروسات والكربون. أدخل شبكات TEM المطلية في كبسولات.

بعد ذلك ، انقل الكبسولات المحملة مع الإمدادات والكواشف الأخرى إلى الاحتواء الحيوي. للبدء ، قم بتوصيل الكبسولة بماصة. استنشق 40 ميكرولتر من تمدد الفيروس في الكبسولة.

ضع الماصة على جانبها ، مع توجيه الشبكات أفقيا لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، التقط الماصة وقم بتوزيع محلول الفيروس في احتواء النفايات. استنشق 40 ميكرولتر من مثبت الجلوتارالديهايد 2٪ في الكبسولات.

ضع الماصة على جانبها لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بطرد المثبت واستنشاق 40 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في الكبسولة ، لغسل المثبت. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بشفط 40 ميكرولترا من أسيتات اليورانيل 1٪ أو حمض فوسفوتنجستيك البوتاسيوم 1٪ في الكبسولة. دع الكبسولة تجلس لمدة 30 ثانية. ثم قم بإزالة الكبسولة من الماصة.

المس قطعة من ورق الترشيح على حافة الشبكات لتجفيفها. انقل ورق الترشيح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. بعد ذلك ، انقع ورق الترشيح في محلول رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 1٪.

ضع الكبسولة مع الغطاء مفتوحا في الأنبوب. أغلق الأنبوب لمدة ساعة واحدة للسماح بالتغلغل الكامل لبخار رابع أكسيد الأوزميوم. بعد ذلك ، قم بتطهير الأنبوب ونقله خارج الاحتواء الحيوي إلى منشأة BSL-2 EM.

قم بإزالة الكبسولة من أنبوب الطرد المركزي، ثم ضعها على ماصة. استنشق 40 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في الكبسولة ثم قم بتوزيع الماء في حاوية نفايات. كرر هذا الغسيل بالماء ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بإزالة الكبسولة من الماصة. باستخدام ورق الترشيح ، جفف الشبكات. اترك الشبكات تجف في الهواء ثم قم بتخزينها في صندوق شبكي ، حتى تصبح جاهزة لإجراء تصوير TEM.

للبدء ، امزج معلق الفيروس بحجم متساو من 4٪ جلوتارالديهايد ، لتحقيق تركيز نهائي قدره 2٪ جلوتارالديهايد. باستخدام المثبت ، قم بتعطيل الفيروس لمدة 24 ساعة على الأقل. تطهير الأنبوب ونقله إلى منشأة BLS-2 EM.

بعد ذلك ، قم بإرفاق التقاط محمل بالشبكة بماصة. استنشق الخليط في الكبسولة. ضع الماصة على جانبها مع توجيه الشبكات أفقيا لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، التقط الماصة وطرد خليط الفيروسات في حاوية النفايات. استنشق 40 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في الكبسولة ثم تخلص من الماء في حاوية نفايات. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بشفط 40 ميكرولترا من 1٪ QA أو 1٪ PTA في الكبسولة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة الكبسولة من الماصة. باستخدام ورق الترشيح ، جفف الشبكات.

ثم اترك الشبكات تجف في الهواء. في هذه الدراسة ، تخضع عينات فيروس زائير للإيبولا من تلطيخ سلبي ، باستخدام كل من طريقة القطرات اليدوية وطريقة الكبسولة. تظهر صور TEM التي تم إنشاؤها من هذه الطرق تفاصيل محددة بوضوح ، مع هياكل نوكليوكابسيد في وسط التباين والبروتينات السكرية المرئية على السطح.

وبالتالي ، فإن طريقة الكبسولة قادرة على إنتاج صور TEM بجودة مماثلة لتلك التي تنتجها طريقة القطرات اليدوية. بعد ذلك ، تتم مقارنة طرق مختلفة لتعطيل العينة باستخدام فيروس شيكونغونيا. يتم تعطيل العينة إما بسرعة ، باستخدام 2٪ جلوتارالديهايد لمدة 20 دقيقة مع التعرض اللاحق لرابع أكسيد الأوزميوم 1٪ لمدة ساعة واحدة ، أو بين عشية وضحاها ، باستخدام 2٪ جلوتارالديهايد لمدة 24 ساعة.

كما يتضح ، فإن عملية التعطيل الأطول بدون رابع أكسيد الأوزميوم تسمح برؤية المزيد من التفاصيل فوق البنية. بعد ذلك ، باستخدام طريقة الكبسولة ، تمت مقارنة بقعتين باستخدام جزيئات شبيهة بالفيروسات الثابتة بالألدهيد. يعرض كل من أسيتات اليورانيل وحمض الفوسفوتونغستيك نتائج عالية الجودة ، مع حدود محددة بوضوح وبروتينات سكرية مرئية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعة ونصف ، اعتمادا على عدد العينات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار الكواشف المثبتة والتلطيخ المناسبة لأهدافك التجريبية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عد الجسيمات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية عن طريق حساب تركيزات الفيروس.

تعمل هذه التقنية على تحسين الطريقة التي يمكن لعلماء الفيروسات من خلالها استكشاف مورفولوجيا الفيروس وبنية المعلومات بسهولة أكبر ، خاصة في الفيروسات من مستوى BLS-3 و 4. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل بسهولة مع شبكات TEM للتلوين السلبي داخل الاحتواء الحيوي. لا تنس أن العمل مع الألدهيد ورباع أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة وغطاء الدخان الكيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.