صمام عزل وتوصيف للفئران الابتدائي الخلايا الخلالي: نموذج جديد لدراسة تكلس الصمام الابهري

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا الخلالية لصمام الفئران أو VICs لدراسة آليات مرض الصمام الأبهري الكلسي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكلس الصمام ، مثل سبب تكلس VICs وما يمكننا منع هذه الخلايا من التكلس. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الوصول وإمكانية التحول إلى خطوط خلوية لمزيد من الدراسات.

قم بإجراء جميع عمليات التشريح في غطاء جيد التهوية تم تطهيره مسبقا ب 70٪ من الإيثانول لضمان عقم العينات والكواشف. تعقيم أدوات التشريح عن طريق تعقيمها ، متبوعا بغمر أطراف الأدوات في دورق يحتوي على 70٪ إيثانول قبل الاستخدام. انقع أدوات التشريح في أكواب من عازلة الغسيل قبل ملامسة أو الأنسجة.

بعد إعدام الفئران كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضع على لوح تشريح زجاجي وقم بتطهير الجلد عن طريق رش 70٪ من الإيثانول. لتشريح القلب ، قم بعمل شق بطول أربعة سنتيمترات في خط الوسط للفأر بمساعدة مقص التشريح لفضح تجويف البطن ، وقم بإزالة القفص الصدري والرئتين بعناية لكشف القلب. قم بإزالة القلب بمقص حاد.

قم بتخزين القلب المقطوع في محلول غسيل مثلج حتى تكتمل جميع التشريح الإجمالي للفئران. لتشريح كل قلب ، انقل القلب المقطوع إلى طبق بتري مغطى بمحلول غسيل. تقليم عضلة القلب باستخدام زوج من المقص المستقيم الزنبركي لتكون على اليسار مع منطقة صغيرة تحيط بالشريان الأورطي الصاعد وجذر الأبهر.

باستخدام نفس المقص الزنبركي المستقيم ، افتح الشريان الأورطي الصاعد بعناية باتجاه البطين الأيسر وكشف وريقات الصمام الأبهري. بعد ذلك ، انقل الشريان الأورطي المفتوح إلى طبق بتري طازج معقم مليء بمحلول الملح المتوازن من هانك. قم بتشريح وريقات الصمام الأبهري المميزة بشكلها الفريد على شكل حرف U في قاعدة الشريان الأورطي باستخدام زوج من مقص Vannas.

قم بتخزين جميع المنشورات في مليلتر واحد من محلول الغسيل المثلج البارد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل حتى تكتمل جميع عمليات التشريح. بمجرد حصاد جميع المنشورات ، قم بطردها بجهاز الطرد المركزي على حرارة 100 جرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية لإزالة مخزن الغسيل. لإزالة الخلايا البطانية للصمام أو VECs ، قم بهضم الوريقات في 100 ميكرولتر سعة 425 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز II لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

قم بتعطيل عملية الهضم عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. جهاز طرد مركزي بوزن 100 جرام لمدة 30 ثانية لتكسير المنشورات. بعد التخلص من المادة الطافية بعناية ، اغسل المنشورات ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل وأعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 جرام لمدة 30 ثانية.

لحصاد VICs من المنشورات ، قم بهضمها باستخدام 100 ميكرولتر من Collagenase II لمدة 1.5 إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية. ثم حرر VICs عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. قم بتخفيف الكولاجيناز II في 19 مل من وسط الاستزراع وجهاز الطرد المركزي عند 670 جم لمدة خمس دقائق لحبيبات VICs وحطام نشرة الصمام المتبقية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، انقل المنشورات و VICs إلى لوحات أو قوارير الاستزراع. استزراع VICs لمدة خمسة إلى سبعة أيام في وسط الاستزراع حتى الوصول إلى التقاء 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 ، وتغيير الوسط بعد 72 ساعة. لإعداد VICs الأولية للفئران لتجارب التكلس في المختبر ، قم بزرع الخلايا بكثافة 150،000 خلية لكل بئر في ألواح من ستة آبار.

الحفاظ على الخلايا في وسط الاستزراع حتى أكثر من 90٪ التقاء. عالج VICs بالتكلس مقابل وسيط التحكم واحتضانه عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة إضافية. لدراسة VICs الأولية المتكلسة للفئران لتحليلات المصب اللاحقة ، قم بإزالة وسط التكلس أو التحكم.

اغسل الطبقات الأحادية بمحلول غسيل لإزالة أيونات الكالسيوم والفوسفات غير المرتبطة قبل إجراء توصيف VIC للفئران كما هو مفصل في بروتوكول النص. لدراسات تكلس VIC للفئران ، قم بتلطيخ الطبقات الأحادية للخلية بمحلول Alizarin Red S بنسبة 5٪ ، مع التأرجح برفق على شاكر لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل ثلاث مرات بالماء المقطر لمدة خمس دقائق في كل مرة.

لتحديد كمية ترسب الكالسيوم ، استخدم مجموعة فحص الكالسيوم الكيميائية الحيوية. أيونات الكالسيوم باستخدام حمض الهيدروكلوريك 0.6 مولار لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية مع تحريض لطيف. احصد المادة الطافية وقياس تركيز الكالسيوم باستخدام مجموعة فحص الكالسيوم باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

أخيرا ، احسب تركيز الكالسيوم كجزء من إجمالي البروتين الخلوي كما هو موضح في بروتوكول النص. تم تأكيد النمط الظاهري ل VIC للخلايا المعزولة من خلال التألق المناعي ، والتحقيق في علامات VIC ، والفيمنتين وأكتين العضلات الملساء ألفا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تأكيد التعبير عن منظم نمو VIC ، عامل نمو الأنسجة beta-1 و 2 ، باستخدام تحليل PCR.

كما تم إجراء تحليل اللطخة الغربية للتحقق من أن VICs للفئران كانت سلبية لعلامة الخلايا البطانية CD 31 ، باستخدام VECs التاجية للكلاب كعنصر تحكم إيجابي. تعرضت VICs للفئران لمستويات مرتفعة من الكالسيوم والفوسفات ، والتي تحاكي حالات فرط كالسيوم الدم المرضي وفرط فوسفات الدم. معالجة VICs بالتكلس الناجم عن الكالسيوم والفوسفات ، على النحو الذي يحدده تلطيخ Alizarin Red لترسب الكالسيوم والتحديد اللوني لمستويات الكالسيوم بعد ترشيح حمض الهيدروكلوريك.

معالجة VICs بالكالسيوم والفوسفات إلى زيادة كبيرة في تعبير mRNA لعلامات العظم MSX2 و ALPL و PHOSPHO1. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين ، باستثناء عملية الهضم ل 18 وريقة صمام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من العقم أثناء التشريح والهضم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل VICs الأولية للفئران واستخدامها للتحقيق في الآليات الكامنة وراء تكلس مركز فيينا الدولي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي وتحليل الفحص المجهري من أجل دراسة فسيولوجيا مركز فيينا الدولي وسلوكه. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية لاستكشاف آليات تصنيفات الصمام الأبهري في البشر باستخدام نموذج الفئران.