الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في ملامح الربط لتعديلات هيستون المختلفة ، باستخدام عينات جنينية منخفضة الوفرة من أجل تحسين التعليق التوضيحي الوظيفي لجينومات الفقاريات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي مثل ، ما هي المعززات والجينات الرئيسية التي تحدد هوية نسيج جنيني معين. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في أنها تتطلب كمية محدودة من مادة معينة ويمكن استخدامها أيضا في كل من التحليل المحلي والمحدد والجينوم على مستوى العالم.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول تنظيم النسخ أو عدم التجانس الخلوي مع الأنسجة الجنينية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل عينات براءات الاختراع. للحصول على المرحلة HH19 ، تحتضن أجنة الدجاج لهذه التجربة بيض دجاجة ليغورن الأبيض الخصب في اتجاه أفقي عند 37 درجة مئوية و 80٪ رطوبة لمدة ثلاثة أيام. لبدء عزل أجنة HH19 ، اجعلها في متناول اليد عن طريق استخراج ثلاثة ملليلتر من الألبومين باستخدام حقنة 10 ملم لخفض الأديم الأريم.

من أجل إزالة الأغشية الجنينية الزائدة ، استخدم مقصا دقيقا لعمل فتحة صغيرة في العين. أضف ملليلتر واحد من محلول القفل. بمساعدة إبرة منحنية ، أضف 0.5 مل من الحبر الأسود الهندي.

استخدم مقصا جراحيا دقيقا وملقطا لقطع الغشاء الجنيني الإضافي الذي يحيط بالجنين. ثم انقل الجنين بملعقة مثقبة إلى طبق بتري بطول 4.5 سم يحتوي على 20 مل من محلول PBS. العمل على الجليد تحت مجهر ستيريو ، استخدم مقصا دقيقا وملقطا لتشريح والتخلص من السلى والأجزاء المتبقية من الغشاء الجنيني الإضافي.

ثم قم بقطع الأنبوب العصبي الشوكي المستعرض أو جزء SNT على المستوى العضدي للجنين. قم بتمديد التشريح ذيليا إلى منطقة الصدر لعزل SNT. للإنهاء ، استخدم الملقط لإزالة الأنسجة التي تحيط بشكل جانبي وبطني ب SNT.

بعد عزل SNTs ، اغمر كل جزء في طبق بتري بطول 3.5 سم يحتوي على 37 درجة مئوية من التربسين الدافئ. عندما يكون ارتخاء الأنسجة غير العصبية حول SNT مرئيا تحت مجهر استريو ، انقل العينات إلى 1x PBS بارد. لإيقاف التربسين ، انقل العينات إلى طبق جديد به DMEM بارد يحتوي على 10٪ FBS.

استخدم الملقط لإزالة الأنسجة المتبقية من اللحمة المتوسطة والأديم الظاهر يدويا من SNT. انقل قسم SNT النظيف هذا إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وقم بتجميده في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بتجانس الأنسجة وفقا لبروتوكول النص.

أضف 13.5 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد واحتضنه في درجة حرارة الغرفة على دوار لمدة 15 دقيقة. لإخماد الفورمالديهايد ، أضف 25 ميكرولترا من 2.5 مولار جلايسين إلى الأنبوب واحتضنه في درجة حرارة الغرفة على دوار لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي للأنبوب ثم اغسل الحبيبات وفقا لبروتوكول النص.

بعد التشابك ، أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من الجليد البارد ، ومحلول التحلل الكامل عن طريق سحب العينات. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية على منصة هزازة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، صوتنة العينات عند أربع درجات مئوية.

بعد صوتنة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 16 ، 000 × G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية أو المحللة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وتخلص من حبيبات الحطام الخلوي. خفف المحللة وفقا لبروتوكول النص.

بعد ذلك ، احتفظ بكمية صغيرة من كل عينة كعنصر تحكم في الإدخال وقم بالتجميد عند 20 درجة مئوية. احتضان العينات المتبقية التي ستتعرض لترسيب الكروماتين أو رقاقة بالأجسام المضادة المناسبة وفقا لبروتوكول النص. ثم أضف 300 ميكرولتر من الكروماتين المرتبط بالأجسام المضادة إلى الخرز المغناطيسي المغسول مسبقا.

اقلب الأنابيب لخلط العينات. لربط الأجسام المضادة بالخرز ، ضع الأنابيب على دوار أنبوبي وقم بتدويرها عموديا عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. لغسل الخرز المرتبط بالكروماتين ، أضف ملليلترا واحدا من محلول غسيل RIPA المثلج البارد إلى الأنبوب المحفوظ على الثلج واخلطه عن طريق قلب الأنبوب أو نقره.

بعد وضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة ، انتظر حتى تستقر الخرزات على الجانب. اسكب السائل الصافي وكرر هذا الغسيل ثلاث مرات أخرى. بعد إضافة مليلتر واحد من كلوريد الصوديوم TE 50 مللي مولار إلى الأنبوب ، انقل حبات الكروماتين المرتبطة بالكروماتين في هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 ملم.

ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي وعندما تستقر الخرزات ، اسكب السائل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للحبات عند 900 × G عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا. بعد تسوية الخرزات في الحامل المغناطيسي ، قم بإزالة جميع TE المتبقية باستخدام طرف تحميل الجل.

العمل في درجة حرارة الغرفة ، أضف 210 ميكرولتر من مخزن الشطف إلى الخرز وأعد تعليقه عن طريق النقر. احتضان الأنبوب في كتلة حرارية دافئة مسبقا عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع الرج. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب بالخرز عند 16 ، 000 × جم في درجة حرارة الغرفة ، لمدة دقيقة واحدة.

بمجرد أن تستقر الخرزات في الحامل المغناطيسي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. قم بإذابة عينة التحكم في الإدخال المجمدة مسبقا من 20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 90 ميكرولترا من محلول الشطف إلى العينة واخلطه عن طريق الدوامة لفترة وجيزة.

لعكس الروابط المتقاطعة ، احتضان الشريحة وعينات التحكم عند 65 درجة مئوية طوال الليل. العمل في درجة حرارة الغرفة ، أضف حجما واحدا من المخزن المؤقت TE لكل أنبوب واقلبها للخلط. لهضم الحمض النووي الريبي ، أضف RNAse A إلى عينات التحكم والرقائق إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ملليغرام لكل مليلتر واقلب الأنابيب للخلط.

احتضان الأنابيب في كتلة حرارية دافئة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. لهضم البروتين لتنقية الحمض النووي اللاحق ، أضف البروتياز K إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ملليغرام لكل مليلتر إلى الأنابيب وقم بقلب الأنابيب للخلط. احتضان الأنابيب في كتلة حرارية دافئة مسبقا عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين.

استخراج وتنقية الحمض النووي وفقا للمواد التكميلية. يمكن الآن استخدام هذا الحمض النووي لإعداد مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي والرقاقة. يتم تأكيد كفاءة صوتنة ضرورية لشريحة ناجحة من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لعينات التحكم في الإدخال.

في هذا المثال ، باستخدام الأنبوب العصبي الشوكي للدجاج أو أقسام SNT ، تم استخدام 11 دورة صوتنة للحصول على حجم شظية مثالي يتراوح من 200 إلى 500 زوج أساسي. تم تحليل الحمض النووي المكسور بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لقياس مستويات تخصيب علامات الهيستون المنشطة والقمعية حول المناطق المحفزة للجينات النشطة وغير النشطة في SNT الدجاج. هذا يدل على أنه من الممكن تقييم الجودة المتكسرة عن طريق تحديد عدد قليل من الجوانب المنخفضة فقط دون فقدان الكثير من الحمض النووي لمزيد من التحليل.

بعد إعداد مكتبات البحث عن الرقائق بالتسلسل ، يظهر جراد تمثيلي لمثيلة H3K27 الثلاثية وشريحة المثيلة الثلاثية H3K4 تبحث عن البيانات التي تم إنشاؤها في SNT الدجاج. كما تم إنشاء ملامح مماثلة لبحث الرقائق بنجاح في الأنسجة الجنينية المختلفة للدجاج ، مثل نتوءات الفك العلوي وأجنة المرحلة HH3. يوضح هذا أنه يمكن استخدام بروتوكول الرقاقة المعروض هنا لإنشاء ملامح جينية من كميات محدودة من الأنسجة الجنينية المختلفة.

باستخدام هذا البروتوكول لإنشاء ملفات تعريف تعديل الهيستون في الأنسجة الجنينية ، من المهم أن تتذكر أن الإشارات ستأتي من جميع أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في هذه الأنسجة. باتباع هذا البروتوكول واستخدام المزيد من المواد البيولوجية الأولية ، يجب أن يكون من الممكن التحقيق في ملفات تعريف الارتباط للبروتينات الأخرى المشاركة في تنظيم النسخ ، مثل عوامل النسخ أو المنشطات المشتركة أو الوحدات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي 2. بمجرد إنشائها ، ستمكن هذه البروتوكولات الباحثين في مجال البيولوجيا التنموية أو علم الوراثة الطبية من تحسين التغيير الوظيفي لجينومات الفقاريات واكتساب رؤى مهمة حول الأساس الجزيئي لتكوين العضل والتطور والأمراض البشرية.