القضاء بسيطة من الأسفار الخلفية في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة للفحص المجهري الفلورة

تتمثل المشكلة الشائعة في الفحص المجهري المناعي في وجود مضان في الخلفية الداخلية يمكن أن يتداخل مع إشارتك. في كثير من الحالات ، يمكن أن يجعل هذا التألق الذاتي نتائجك غير قابلة للتفسير. في هذا البروتوكول ، سنوضح كيفية إزالة التألق الذاتي من عينات أنسجة المخ البشري باستخدام التبييض الضوئي باستخدام مصباح مكتبي LED تجاري.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطرق في توفير كبير في التكاليف مقارنة بالتقنيات الحالية دون التضحية بالفعالية وعدم إدخال أي مركبات خارجية في العينة. قبل أن تبدأ ، قم بإعداد محاليل المرق من محلول ملحي ثلاثي المخزن مرة واحدة ، TBS ، و 10٪ أزيد الصوديوم. لكل ثلاث شرائح مجهرية ذات حجم قياسي ترغب في معالجتها ، ستحتاج إلى طبق بتري واحد بحجم 100 ملم × 100 ملم مربع كغرفة شريحة.

لكل غرفة شريحة ، قم بإعداد 50 مل من أزيد 05٪ في TBS عن طريق إضافة 25 مل من أزيد الصوديوم بنسبة 10٪ إلى 50 مل من مرة واحدة في TBS. قم بإنشاء سقالة لرفع غرفة الشرائح بحيث يمكن وضع رأس المصباح تحتها. بالنسبة لطبق بتري مربع 100 ملم ، يمكن قطع حاوية طعام بلاستيكية بنفس الحجم حسب الشكل.

يمكن استخدام أي شيء يمكنه رفع غرفة الانزلاق بشكل آمن دون إعاقة الضوء من الوصول إلى العينات. احصل على مصباح مكتبي LED فوسفوري أبيض وقم بإزالة أي ناشرات أو بلاستيك غير شفاف يغطي مصدر الضوء. قم بتوجيه مجموعة LED لأعلى.

لهذا الغرض يوصى باستخدام مصباح برقبة مرنة. قم ببناء غطاء قبة عاكس للجهاز عن طريق إضاءة الجزء الداخلي من صندوق كبير بما يكفي لتغطية غرف الشرائح والسقالة بورق الألمنيوم. بالنسبة للغرفة الواحدة، يمكن استخدام صندوق طرف ماصة بحجم ملليمتر واحد.

في هذا الفيديو ، تم إخضاع أنسجة المخ الجبهية الأمامية المدارية FTLD-T للمعالجة المسبقة للتبييض الضوئي. قد تختلف إجراءات تحضير الأنسجة والتلوين الأميني بناء على مصدر أقسام الأنسجة وتثبيتها وتضمينها. في غرفة باردة بأربع درجات مئوية أو خزانة باردة أو ثلاجة ، ضع المصباح أسفل السقالة وغرفة العينة أعلى السقالة.

املأ حجرة العينة ب 50 مل من أزيد TBS. اغمر أقسام الأنسجة بسمك 10 ميكرومتر المثبتة على شرائح مجهر زجاجي قياسية في غرفة العينة باستخدام ملقط نظيف. قم بتغطية الجهاز بالقبة العاكسة وقم بتشغيل مصباح LED.

اسمح للعينات بالتبييض الضوئي لمدة 48 ساعة. قد يختلف وقت الحضانة هذا ، اعتمادا على شدة المصباح وكمية مادة الفلورسنت الذاتي في الأنسجة. بعد المعالجة المسبقة للتبييض الضوئي ، يمكن تلطيخ الشرائح ببروتوكول قياسي للأنسجة والبروتينات التي تهمك.

لأغراض العرض التوضيحي ، تم تلطيخ أنسجة المخ FTLD-T من أجل تاو الفسفوري باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ب Alexa 488 و Texas Red. تم استخدام DAPI كبقعة نووية. تحضير 500 مل من المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد ، و 500 مل من 0.025٪ Triton X-100 في TBS ، و 10 ملليلتر من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 1٪ ، BSA ، في TBS ، ومليلترين من محلول الحجب ، يتكون من مصل الماعز المضاف إلى BSA TBS.

قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غمر الشرائح المبيضة ضوئيا في مخزن مؤقت لاسترجاع المستضد في مجمع الشرائح. سخني المجمع على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد إزالة المجمع من المعالجة الحرارية ، من المهم السماح للغرفة بالتبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ستؤدي إزالة الشرائح على الفور إلى جفاف الأقسام. قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الأساسي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. في هذه الحالة ، تم تخفيف الجسم المضاد المضاد للفوسفو PHF tau p-serine 202 بالإضافة إلى threonine 205 AT8 واحدا من كل 100 باستخدام BSA TBS وتركه على الجليد.

مطلوب 150 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة لكل قسم. بعد أن تبرد الأقسام لمدة 30 دقيقة ، انقل الشرائح من مجمع استرجاع المستضد إلى وعاء تلطيخ مملوء ب TBS Triton. اغسل الشرائح في هذا المحلول لمدة خمس دقائق مع رج لطيف.

أفرغ واستبدل TBS Triton لتكرار خطوة الغسيل هذه مرة ثانية. بعد الغسيل ، قم بإزالة الشرائح من برطمان التلوين وتخلص من أي عازل زائد. باستخدام قلم مسعور ، ارسم مخططا حول الأنسجة.

سيمنع هذا حلولك من الخروج من الشريحة. احرص على عدم ترك الشرائح تجف. قم بسد الأنسجة عن طريق سحب 200 ميكرولتر من محلول المانع على الشرائح ووضعها داخل غرفة رطبة.

يمكن أن تكون هذه الغرفة شيئا بسيطا مثل رف منزلق داخل صندوق طرف الماصة الذي يحتوي على منشفة ورقية مبللة. تأكد من تغطية عينة الأنسجة بالكامل بمحلول مانعب. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

قم بإزالة المحلول المسدود بواسطة الشفاط أو الماصة. ماصة من 100 إلى 150 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية على الشرائح. تأكد من تغطية العينة بأكملها بمحلول الأجسام المضادة وأن الأقسام محفوظة على سطح مستو لتجنب التجمع غير المتكافئ للأجسام المضادة.

احتضان الجسم المضاد الأولي عند أربع درجات مئوية طوال الليل في غرفة رطبة. في اليوم التالي ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوية. في هذه الحالة ، تم تخفيف الماعز المضاد للفأر Alexa 488 والماعز المضاد للفأر Texas Red واحدا من كل 100 باستخدام BSA TBS.

استرجع أقسام الأنسجة وقم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي بواسطة الشفاط أو الماصة. اغسل الشرائح مرتين بطريقة مماثلة لما سبق أن استخدمه في السابق باستخدام برطمان تلطيخ مملوء ب TBS Triton لمدة خمس دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل ، قم بإزالة أي مخزن مؤقت زائد.

الماصة من 100 إلى 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية ، مما يضمن مرة أخرى تغطية عينة الأنسجة بالكامل. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الغرفة المرطبة في الظلام. قم بإعداد 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر DAPI Counterstain في TBS وفقا لتوصيات الشركة المصنعة أو التخفيف التسلسلي.

تأكد من خلط محلول مخزون DAPI جيدا بسبب عدم الذوبان المحتمل. استرجع الشرائح وقم بإزالة خليط الجسم المضاد الثانوي. اغسل العينات مرتين ، ولكن بدلا من استخدام TBS Triton ، استخدم TBS العادي.

قم بشفط محلول الغسيل المتبقي أو ماصته وقم بوضع 100 إلى 150 ميكرولتر من صبغة DAPI على أقسام الأنسجة. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استرجع العينات واغسلها ثلاث مرات باستخدام TBS عادي بدلا من اثنتين.

بعد الغسيل ، قم بإزالة محلول الغسيل المتبقي بعناية. تطبيق التركيب المتوسط. أكمل تركيب الشريحة عن طريق تغطية العينات بزلات غطاء زجاجي.

تجنب الفقاعات عن طريق وضع إحدى حواف الغطاء التي تنزلق لأسفل وخفض الحافة المقابلة ببطء شديد باستخدام الملقط. اترك وسائط التركيب تجف قبل تخزينها على درجة حرارة أربع درجات مئوية في الظلام. الشرائح جاهزة الآن للتصور.

ستختلف إعدادات الفحص المجهري الفلوري اعتمادا على الفلوروفورات المستخدمة في التلوين والمجهر. قم بتشغيل المصباح الفلوري والمجهر والكمبيوتر ، واترك المصباح يسخن لمدة 15 دقيقة. ضع شرائح الأنسجة الملطخة في المجهر الفلوري.

استخدم المجال الساطع لتحديد موقع الأنسجة بتكبير 10 مرات. بمجرد تحديد موقع منطقة مناسبة من الأنسجة ، أضف قطرة ماء فوق زلة غطاء العينة. قم بالتبديل إلى عدسة غمر الماء 20 مرة.

حدد أطوال موجات الإثارة والانبعاث بالليزر المناسبة لكل فلوروفور في مسارات منفصلة للحصول على أفضل إشارة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الإعدادات والأطوال الموجية المستخدمة في المخطوطة المصاحبة. اضبط إعدادات طاقة الليزر واكتساب ليزر لتحسين شدة الإشارة لكل مسار.

بمجرد العثور على الإعدادات ومجال الرؤية المناسبين ، احفظ صورة مركبة تحتوي على بيانات التألق من كل مسار. لتصور شدة التألق في كل قناة، قم بتثبيت ماكرو RGB Profile Tools ل ImageJ. افتح ملف الصورة متحد البؤر lsm في ImageJ وقم بتحويل الصور المركبة من المكدسات الثلاثة إلى RGB بالانتقال إلى الصورة واللون وأداة القناة.

حدد مركب وتحقق من القنوات الثلاث. بعد ذلك ، انتقل إلى الصورة والنوع ولون RGB. حدد أيقونة أدوات ملف تعريف RGB وارسم خطا عبر القسم في الصورة المراد توصيفه.

في هذا الفيديو ، تم وصف خطوات إجراء المعالجة المسبقة للتبييض الضوئي لعينات الأنسجة لإنتاج مضان الخلفية. يمكن إضافة هذا الإجراء إلى أي بروتوكول مضان أميني قياسي قبل استرجاع المستضد والتلوين الأميني. الجهاز المستخدم في التبييض الضوئي غير مكلف ويمكن الحصول عليه بسهولة ، ويتكون من مكونات جاهزة.

تنبعث مصابيح LED الفوسفورية البيضاء من الضوء عبر مجموعة واسعة من الأطوال الموجية ، مما يجعلها مناسبة للغاية للتبييض الضوئي واسع النطاق. باستخدام مصباح مكتبي LED متاح بسهولة ، تم تبييض عينات أنسجة المخ البشرية غير الملوثة FTLD-T وتصويرها باستخدام الأطوال الموجية التي ستكون مناسبة إذا كانت هذه العينات ملطخة ب Texas Red و Alexa 488. أظهرت العينات غير المعالجة كميات كبيرة من التألق الذاتي.

في المقابل ، أدى التبييض الضوئي إلى انخفاض كبير في شدة بقع التألق الذاتي التي تشبه الليبوفوسين ، بالإضافة إلى مضان الخلفية العامة. لمزيد من التحقق من صحة هذه التقنية ، تم تلطيخ عينات أنسجة المخ FTLD-T من أجل تاو مفرط الفسفرة ، وهو بروتين يتخالف ويتراكم في هذا المرض كأجسام شمولية متميزة. تم تطبيق جسمين مضادين ثانويين مختلفين للتمييز بشكل أفضل بين وضع العلامات على تاو والتألق غير المحدد.

في هذه الصور المركبة ، يظهر تحديد موقع Alexa 488 و Texas Red باللون الأصفر ، والذي يمثل بروتين تاو الملون بشكل صحيح. يشير ظهور المناطق الحمراء أو الخضراء إما إلى تألق غير محدد أو تبريد أحد الكروموفورات. في عينة التحكم غير المعالجة ، يمكن رؤية خلفية كبيرة وإشارة غير محددة ، لا سيما في قناة تكساس الحمراء.

ينتج عن كل من المعالجة المسبقة للتبييض الضوئي ، بالإضافة إلى تطبيق المروي الكيميائي إشارة خلفية منخفضة للغاية. إذا قمنا بتقسيم قنوات التألق ونظرنا إلى الصور تحت تكبير أعلى ، فيمكن إجراء ملاحظات أكثر تفصيلا. يمتلك عنصر التحكم غير المعالج مضان في الخلفية عبر جميع القنوات ، بالإضافة إلى ميزات غير محددة ، خاصة في قناة Texas Red ، التي لها كثافة مماثلة لوضع العلامات الخاصة ب tau.

إذا لم يكن لأجسام تضمين تاو مورفولوجيا مميزة ويمكن التنبؤ بها ، فقد يساء تفسير نتائج Texas Red هذه بسبب وجود هذه الميزات الفلورية الذاتية. تلغي المعالجة المسبقة للتبييض الضوئي تماما ميزات Texas Red غير المحددة هذه ، مع الحفاظ على غالبية إشارات Texas Red و Alexa 488 الخاصة بالتاو. ومع ذلك ، يبدو أن التبييض الضوئي له تأثير ضئيل على تألق خلفية DAPI.

قلل التبريد الكيميائي من تألق الخلفية في قناة Alexa 488 بنفس فعالية التبييض الضوئي. ومع ذلك ، فقد قلل أيضا من شدة التألق لكل من DAPI و Texas Red ، مما يشير إلى وجود بعض التبريد الذي يؤدي إلى نتائج عكسية. يمكن رؤية القياس الكمي لهذه التأثيرات في ملفات تعريف الإشارة.

كما ترى ، تنتج هذه الطريقة صورا نظيفة خالية من الميزات المربكة. يمكن دمج المعالجة المسبقة للتبييض الضوئي هذه في أي بروتوكول مضان أميني قياسي لإزالة التألق الذاتي وتوليد نتائج عالية الجودة لا لبس فيها.