القضاء بسيطة من الأسفار الخلفية في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة للفحص المجهري الفلورة

تعد مشكلة الفلورة الخلفية الداخلية الشائعة في مجهر الفلورة المناعية من العوائق التي قد تتداخل مع الإشارة الناتجة. وفي كثير من الحالات، يمكن لهذه الفلورة الذاتية أن تجعل النتائج غير قابلة للتفسير. سنقوم في هذا البروتوكول بتوضيح كيفية إزالة الفلورة الذاتية من عينات أنسجة الدماغ البشري باستخدام التبييض الضوئي بواسطة مصباح مكتب LED تجاري.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطرق في التوفير الكبير في التكاليف مقارنة بالتقنيات الحالية دون المساس بالفعالية، بالإضافة إلى عدم إدخال أي مركبات خارجية إلى العينة. قبل البدء، قم بتحضير المحاليل المخزنة من محلول ملحي منظم بالتريس بتركيز 1x، TBS، وأزيد الصوديوم بنسبة 10%. ولكل ثلاث شرائح مجهرية ذات حجم قياسي ترغب في معالجتها، ستحتاج إلى طبق بتري مربع واحد بمقاس 100 مليمتر في 100 مليمتر كغرفة للشرائح.

لكل غرفة شريحة، قم بتحضير 50 ملليلتر من azide بتركيز 0.5% في TBS عن طريق إضافة 25 ملليلتر من sodium azide بتركيز 10% إلى 50 ملليلتر من TBS بتركيز مرة واحدة. قم بإنشاء دعامة لرفع غرفة الشريحة بحيث يمكن تركيب رأس المصباح أسفلها. بالنسبة لطبق بتري مربع بمقاس 100 ملليمتر، يمكن قص حاوية طعام بلاستيكية ذات حجم مماثل لتناسب الشكل.

يمكن استخدام أي شيء يمكنه رفع حجرة الشريحة بشكل آمن دون إعاقة وصول الضوء إلى العينات. احصل على مصباح مكتب LED بفسفور أبيض وقم بإزالة أي موزعات أو بلاستيك معتم يغطي مصدر الضوء. وجه مصفوفة LED إلى الأعلى.

لهذا الغرض، يوصى باستخدام مصباح ذو عنق مرن. قم بتصنيع غطاء قبة عاكس للجهاز عن طريق تبطين الجزء الداخلي لصندوق كبير بما يكفي لتغطية غرف الشرائح والسقالة بورق الألمنيوم. وفي حالة استخدام غرفة واحدة، يمكن استخدام صندوق رؤوس ماصات سعة 1 ملم.

في هذا الفيديو، خضعت أنسجة الدماغ البشرية من التلافيف الجبهية الحجاجية المصابة بمرض FTLD-T والمثبتة بالفورمالين لمعالجة مسبقة بالتبييض الضوئي. قد تختلف إجراءات تحضير الأنسجة وصبغ الأحماض الأمينية بناءً على مصدر مقاطع الأنسجة وطريقة تثبيتها وطمرها. في غرفة تبريد أو خزانة تبريد أو ثلاجة عند درجة حرارة 4 °C، ضع المصباح أسفل السقالة وحجرة العينة فوق السقالة.

املأ حجرة العينة بـ 50 milliliters من محلول azide TBS. اغمر مقاطع نسيجية بسُمك 10 micrometer مثبتة على شرائح مجهرية زجاجية قياسية في حجرة العينة باستخدام ملقط نظيف. غطِّ الجهاز بالقبة العاكسة ثم قم بتشغيل مصباح LED.

اترك العينات لتتعرض للتبييض الضوئي لمدة 48 ساعة. قد تختلف مدة الحضانة هذه اعتماداً على شدة المصباح وكمية المواد ذات الفلورة الذاتية في النسيج. وبعد المعالجة المسبقة بالتبييض الضوئي، يمكن صبغ الشرائح مناعياً باستخدام بروتوكول قياسي يتناسب مع النسيج والبروتينات المحددة محل الدراسة.

لأغراض التوضيح، تم صبغ أنسجة دماغ مصابة بـ FTLD-T للكشف عن بروتين tau المفسفر باستخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ Alexa 488 و Texas Red. كما استُخدم DAPI كصبغة مضادة للنواة. قم بتحضير 500 milliliters من محلول استعادة المستضد، و 500 milliliters من Triton X-100 بنسبة 0.025% في TBS، و 10 milliliters من ألبومين المصل البقري بنسبة 1%، BSA، في TBS، وملليلترين من محلول الحجب، المكون من مصل الماعز المضاف إلى BSA TBS.

قم بإجراء عملية استعادة المستضد عن طريق غمر الشرائح التي خضعت للتبييض الضوئي في محلول استعادة المستضد داخل جامع شرائح. سخّن الجامع عند 90 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. وبمجرد إخراج الجامع من المعالجة الحرارية، من المهم ترك الغرفة لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

سيؤدي إزالة الشرائح على الفور إلى جفاف المقاطع. قم بتحضير خليط الأجسام المضادة الأولية وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. في هذه الحالة، تم تخفيف الجسم المضاد anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 بنسبة 1 إلى 100 باستخدام BSA TBS وتُرك على الثلج.

يلزم 150 µL من خليط الأجسام المضادة لكل مقطع. بعد تبريد المقاطع لمدة 30 دقيقة، انقل الشرائح من وعاء استعادة المستضد إلى وعاء صبغ مملوء بـ TBS Triton. اغسل الشرائح في هذا المحلول لمدة خمس دقائق مع الرج اللطيف.

قم بتفريغ محلول TBS Triton واستبداله لتكرار خطوة الغسل هذه للمرة الثانية. بعد الغسل، أخرج الشرائح من وعاء الصبغ وجفف أي محلول منظم زائد. وباستخدام قلم كاره للماء، ارسم إطارًا حول النسيج.

سيمنع ذلك محاليلك من السيلان خارج الشريحة. احرص على عدم ترك الشرائح لتجف. قم بحجب النسيج عن طريق سحب 200 µL من محلول الحجب ونقله إلى الشرائح، ثم ضعها داخل غرفة ترطيب.

يمكن أن تكون هذه الحجرة بسيطة للغاية، مثل حامل شرائح داخل صندوق رؤوس الماصات يحتوي على مناديل ورقية مبللة. تأكد من تغطية عينة النسيج بالكامل بمحلول الحجب. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

قم بإزالة المحلول الحاجب باستخدام جهاز الشفط أو الماصة. قم بنقل من 100 إلى 150 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية إلى الشرائح. تأكد من تغطية العينة بأكملها بمحلول الأجسام المضادة ومن بقاء المقاطع على سطح مستوٍ لتجنب التجمع غير المتساوي للأجسام المضادة.

يتم التحضين مع الجسم المضاد الأولي عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل في غرفة رطبة. وفي اليوم التالي، يتم تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية. في هذه الحالة، تم تخفيف goat anti-mouse Alexa 488 و goat anti-mouse Texas Red بنسبة 1:100 باستخدام BSA TBS.

استرجع مقاطع الأنسجة وأزل محلول الأجسام المضادة الأولية باستخدام الشفاط أو الماصة. اغسل الشرائح مرتين بطريقة مماثلة لما سبق باستخدام وعاء صبغ مملوء بـ TBS Triton لمدة خمس دقائق في كل غسلة. بعد الغسل، قم بإزالة أي فائض من المحلول المنظم باستخدام ورق الترشيح.

قم بنقل 100 إلى 150 µL من محلول الجسم المضاد الثانوي باستخدام الماصة، مع التأكد مرة أخرى من تغطية عينة النسيج بالكامل. حضّن العينة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة وفي الظلام. قم بتحضير صبغة DAPI المقابلة بتركيز 0.1 µg/mL في محلول TBS وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة أو عن طريق التخفيف التسلسلي.

تأكد من خلط المحلول المخزون من DAPI جيداً نظراً لاحتمالية عدم الذوبان. استرجع الشرائح وقم بإزالة خليط الأجسام المضادة الثانوية. اغسل العينات مرتين، ولكن بدلاً من استخدام TBS Triton، استخدم TBS العادي.

قم بشفط أو سحب محلول الغسيل المتبقي، ثم ضع من 100 إلى 150 µL من صبغة DAPI على قطاعات الأنسجة. تُحضن العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استعد العينات واغسلها ثلاث مرات باستخدام محلول TBS العادي بدلاً من مرتين.

بعد الغسيل، قم بإزالة محلول الغسيل المتبقي بعناية. ضع وسط التثبيت. استكمل عملية تثبيت الشريحة بتغطية العينات بصفائح غطاء زجاجية.

تجنب تكون الفقاعات عن طريق وضع حافة واحدة من غطاء الشريحة أولاً، ثم خفض الحافة المقابلة ببطء شديد باستخدام الملقط. اترك وسيط التثبيت ليجف قبل التخزين في درجة حرارة 4 °C في الظلام. والآن أصبحت الشرائح جاهزة للفحص المجهري.

ستختلف إعدادات المجهر الفلوري بناءً على الفلوروفورات المستخدمة في الصبغ ونوع المجهر. قم بتشغيل المصباح الفلوري والمجهر والكمبيوتر، واترك المصباح يسخن لمدة 15 دقيقة. ضع شرائح الأنسجة المصبوغة في المجهر الفلوري.

استخدم الحقل المضيء لتحديد موقع النسيج بتكبير 10 مرات. بمجرد تحديد منطقة مناسبة من النسيج، أضف قطرة من الماء فوق الشريحة الغطاء للعينة. انتقل إلى عدسة غمر مائي بتكبير 20 مرة.

اختر أطوال موجات إثارة وانبعاث الليزر المناسبة لكل فلوروفور في مسارات منفصلة للحصول على أفضل إشارة. يمكن العثور على تفاصيل إضافية حول الإعدادات وأطوال الموجات المستخدمة في المخطوطة المرفقة. اضبط إعدادات قدرة الليزر والكسب لتحسين كثافة الإشارة لكل مسار.

بمجرد العثور على الإعدادات المناسبة ومجال الرؤية، احفظ صورة مركبة تحتوي على بيانات الفلورة من كل مسار. ولتصوير كثافة الفلورة في كل قناة، قم بتثبيت الماكرو RGB Profile Tools لبرنامج ImageJ. افتح ملف صورة المجهر البؤري الماسح lsm في برنامج ImageJ وقم بتحويل الصور المركبة من المجموعات الثلاث إلى RGB من خلال الانتقال إلى Image، ثم Color، ثم Channel Tool.

اختر Composite وقم بتفعيل القنوات الثلاث جميعاً. بعد ذلك، انتقل إلى Image ثم Type ثم RGB Color. اختر أيقونة RGB Profile Tools وارسم خطاً عبر الجزء المراد معايرته في الصورة.

في هذا الفيديو، تم وصف خطوات إجراء معالجة أولية بالتبييض الضوئي لعينات الأنسجة لتقليل الفلورة الخلفية. يمكن إضافة هذا الإجراء إلى أي بروتوكول قياسي للفلورة المناعية قبل عملية استعادة المستضد والصبغ المناعي. إن الجهاز المستخدم في التبييض الضوئي غير مكلف وسهل الحصول عليه، حيث يتكون من مكونات تجارية جاهزة.

تبعث صمامات LED ذات الفسفور الأبيض ضوءاً عبر طيف واسع من الأطوال الموجية، مما يجعلها مناسبة للغاية لعملية التبييض الضوئي واسعة النطاق. وباستخدام مصباح مكتب LED متاح بسهولة، تم تبييض عينات من أنسجة دماغ بشرية مصابة بمرض FTLD-T غير مصبوغة ضوئياً وتصويرها باستخدام الأطوال الموجية التي تكون مناسبة في حال صبغ هذه العينات بصبغتي Texas Red و Alexa 488. وقد أظهرت العينات غير المعالجة كميات كبيرة من التألق الذاتي.

على النقيض من ذلك، أدى التبييض الضوئي إلى تقليل شدة بقع التألق الذاتي التي تشبه الليبوفوسين بشكل ملحوظ، بالإضافة إلى تقليل تألق الخلفية العام. ولمزيد من التحقق من هذه التقنية، تم صبغ عينات من أنسجة دماغ مصابة بـ FTLD-T للكشف عن بروتين tau مفرط الفسفرة، وهو بروتين يطوي بشكل خاطئ ويتراكم في هذا المرض على شكل أجسام اشتمالية متميزة. وقد تم استخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية المختلفة للتمييز بشكل أفضل بين وسم tau والتألق غير النوعي.

في هذه الصور المركبة، يظهر التوضع المشترك لـ Alexa 488 وTexas Red باللون الأصفر، والذي يمثل بروتين tau المصبوغ بشكل صحيح. ويشير ظهور المناطق الحمراء أو الخضراء إما إلى تألق غير نوعي أو خمود لأحد الكروموفورات. وفي عينة الضابطة غير المعالجة، يمكن ملاحظة خلفية وإشارات غير نوعية كبيرة، خاصة في قناة Texas Red.

يؤدي كل من المعالجة المسبقة بالتبييض الضوئي وتطبيق الموخم الكيميائي إلى تقليل إشارة الخلفية بشكل كبير. وإذا قمنا بفصل قنوات الفلورية وفحص الصور تحت تكبير أعلى، يمكن إجراء ملاحظات أكثر تفصيلاً. تظهر العينة الضابطة غير المعالجة فلورية خلفية في جميع القنوات، بالإضافة إلى سمات غير محددة، خاصة في قناة Texas Red، ذات شدة مشابهة لوسم tau النوعي.

إذا لم تكن الأجسام الاشتمالية لبروتين tau ذات مورفولوجيا مميزة ويمكن التنبؤ بها، لكان من الممكن تفسير نتائج Texas Red بشكل خاطئ بسبب وجود هذه السمات ذات الفلورة الذاتية. تؤدي المعالجة المسبقة بالتبييض الضوئي إلى إزالة هذه السمات غير النوعية لـ Texas Red تماماً، مع الحفاظ على غالبية إشارات Texas Red و Alexa 488 النوعية لبروتين tau. ومع ذلك، يبدو أن التبييض الضوئي له تأثير ضئيل على الفلورة الخلفية لـ DAPI.

قلل المطفئ الكيميائي من الفلورية الخلفية في قناة Alexa 488 بنفس فعالية التبييض الضوئي. ومع ذلك، فقد قلل أيضاً من شدة الفلورية لكل من DAPI وTexas Red، مما يشير إلى وجود بعض الإخماد غير المرغوب فيه. ويمكن رؤية التقييم الكمي لهذه التأثيرات في ملفات الإشارة.

كما تلاحظون، تنتج هذه الطريقة صوراً واضحة خالية من السمات المربكة. ويمكن دمج معالجة التبييض الضوئي هذه في أي بروتوكول قياسي لفلورة الأحماض الأمينية لإزالة الفلورة الذاتية وتوليد نتائج عالية الجودة وغير غامضة.