الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

الهدف العام من مقال الطرق هذا هو تقديم البروتوكولات المفصلة التي يستخدمها مختبرنا لدراسة التعرف الجزيئي على الحمض النووي الريبي (RNA) مزدوج السلاسل بواسطة أحماض نووية ببتيدية معدلة كيميائياً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا الكيميائية لـ RNA، مثل الكشف عن هياكل RNA واستهدافها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن مبادئ التصميم يمكن تطبيقها لاستهداف أي هياكل ازدواجية لـ RNA.

ستقوم ديسيري تو، وهي باحثة مشاركة من مختبري، بشرح هذا الإجراء. لبدء هذا الإجراء، أضف 4 µL من محلول glycerol بتركيز 35% إلى عينات RNA PNA التي تم تحضيرها مسبقاً وامزجها بلطف. وباستخدام ماصة دقيقة ورؤوس تحميل الجل، انقل بعناية 20 µL من كل عينة إلى جل polyacrylamide تم تحضيره مسبقاً، مع التأكد من عدم إدخال أي فقاعات هوائية.

قم بتشغيل الهلام بجهد ثابت قدره 250 فولت لمدة خمس ساعات. وبعد مرور خمس ساعات، أوقف تشغيل مزود الطاقة وأخرج اللوح الزجاجي من حامل الهلام. ثم قم بإزالة شريط إغلاق الهلام وتفكيك اللوح الزجاجي.

أزل الهلام برفق من اللوح الزجاجي وضعه في وعاء مملوء بـ 350 milliliters من الماء منزوع الأيونات. أضف بعناية 35 microliters من بروميد الإيثيديوم إلى الوعاء وضعه على هزاز المنصة بسرعة منخفضة لمدة 30 minutes. بعد التخلص من محلول بروميد الإيثيديوم، اشطف الهلام بـ 1.5 إلى 2 liters من الماء المقطر.

بعد ذلك، يتم مسح الهلام باستخدام جهاز تصوير مزود بليزر أخضر بطول موجي 532 نانومتر ومع ضبط مرشح الانبعاث عند 610 نانومتر. ثم يتم قياس كثافة حزم الهلام باستخدام برنامج مجاني. انقل الكمية المناسبة من الـ RNA مزدوج السلسلة والموسوم بـ 2-aminopurine إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك، قم بتركيز محاليل RNA باستخدام جهاز تركيز بالتفريغ. ثم، انقل الأحجام المناسبة من PNA المستهدف بتركيزات مختلفة من المخزون الرئيسي المُحضّر مسبقاً إلى أنابيب منفصلة سعة 1.5 ملليلتر. قم بتركيز محاليل PNA باستخدام جهاز التركيز بالتفريغ.

أضف 975 µL من منظم الحضن (incubation buffer) إلى الأنبوبة التي تحتوي على الـ RNA المجفف، وامزج جيداً لضمان ذوبان جميع الـ RNA. بعد إجراء عملية طرد مركزي قصيرة لمحلول الـ RNA، قم بإجراء عملية التلدين (annealing) عن طريق وضع الأنبوبة في كتلة تسخين مُسخنة مسبقاً لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء، أوقف تشغيل كتلة التسخين واترك العينة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

أضف 75 µL من الـ RNA إلى كل أنبوب يحتوي على PNA مجفف واخلط جيداً. بعد ترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل، قم بتحضينها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. الآن، انقل الكميات المناسبة من الـ RNA أحادي السلسلة المسمى بـ 2-aminopurine إلى أنابيب منفصلة سعة 1.5 mL.

انقل الأحجام المناسبة من PNA المستهدف لتركيزات مختلفة من المخزون الرئيسي إلى الأنابيب المقابلة التي تحتوي على RNA أحادي السلسلة. وبعد تجفيف العينات، أضف 75 µL من منظم حضن إلى كل أنبوب واخلط جيداً. قم بإجراء عملية التلدين لكل عينة عن طريق وضع كل أنبوب في كتلة تسخين مجهزة مسبقاً لمدة 10 دقائق.

بعد ترك العينات لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، يتم تحضينها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد ذلك، يتم نقل 70 µL من كل عينة إلى كيوفيت بمقاس 1 cm². ضع الكيوفيت في مقياس الطيف الفلوري وقم بقياس الانبعاث عبر نطاق طول موجي يتراوح من 330 إلى 550 nm.

بمجرد اكتمال القياس، قم بإزالة المحلول المنظم من الكيوفيت. اشطف الكيوفيت بالماء المقطر وجففه باستخدام غاز النيتروجين. وبعد تكرار القياس لجميع العينات، قم برسم شدة الفلورة مقابل الطول الموجي.

انقل الكميات المناسبة من الـ RNA أحادي السلسلة إلى أنابيب منفصلة سعة 1.5 ملليلتر. ثم انقل الأحجام المناسبة من الـ PNA المستهدف من المخزون الرئيسي إلى الأنابيب المقابلة التي تحتوي على الـ RNA أحادي السلسلة. بعد تجفيف العينات، أضف 130 µL من محلول الحضانة المنظم إلى كل أنبوب وامزج جيداً.

أخضع كل عينة لعملية التلدين عن طريق وضع كل أنبوب في كتلة تسخين مسخنة مسبقاً لمدة 10 دقائق. وبعد ترك العينات تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، قم بتحضينها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. الآن، انقل 130 µL من كل عينة إلى كوفيت ثمانية الخلايا المجهرية بحيث تحتوي خلية واحدة على محلول التحضين المنظم.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis spectrophotometer)، قم بقياس الامتصاصية لكل عينة عند 260 nanometers. يتم القياس مع زيادة درجة الحرارة من 15 إلى 95 degrees Celsius، تليها عملية خفض درجة الحرارة من 95 إلى 15 degrees Celsius بمعدل تدرج قدره 0.5 degrees Celsius في الدقيقة. تم الحصول على أوليغومرات PNA بعد عمليتي تنقية باستخدام تقنية HPLC ذات الطور المعكوس.

يمكن تأكيد هوية حمض PNA النووي من خلال تحليل MALDI/TOF. وتشير بيانات الفصل الكهربائي للهلام بتركيز بولي أكريلاميد غير الممسّخ (nondenaturing PAGE) إلى أن PNA المعدل بـ Q و L يمكنه التعرف فقط على منطقة RNA مزدوجة السلاسل تحتوي على زوج C-G. ويحدث هذا التعرف النوعي والمعزز من خلال تكوين ثلاثية مكونة من قاعدتين بين PNA RNA و T-A-U-L-G-C و Q-C-G PNA.

أظهرت دراسة معايرة فلورية باستخدام 2-aminopurine أن حمض PNA المعدل بـ Q و L يرتبط بحمض RNA مزدوج السلسلة المستهدف ولكن ليس بحمض RNA أحادي السلسلة. لا تظهر أحماض PNA التي تحتوي على بقايا Q انتقالات صهر حراري، مما يشير إلى عدم الارتباط بحمض RNA أحادي السلسلة بسبب التنافر الفراغي في زوج Q-G الشبيه بزوج Watson-Crick. ومقارنة بـ PNA P1 غير المعدل، تظهر أحماض PNA P4 و P5 التي تحتوي على بقايا L درجة حرارة صهر أقل للمعقدات المزدوجة من RNA PNA المقابلة بسبب التنافر الفراغي في زوج L-G الشبيه بزوج Watson-Crick.

تتوافق بيانات الانصهار الحراري التي تم اكتشافها عبر امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) مع بيانات معايرة فلورية 2-aminopurine، والتي تظهر أيضاً أن الـ PNA الذي يحتوي على بقايا Q و L لا يرتبط بقوة بالـ RNA أحادي السلسلة. إن دمج قاعدة Q يسبب عدم استقرار أكبر من قاعدة L، حيث أن قاعدة Q تسبب تعارضاً فراغياً أكثر أهمية عند تكوين زوج Q-G الشبيه بزوج واتسون-كريك. وبمجرد إتقانها، يمكن إجراء التجارب المختلفة في غضون أسبوع إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل سبر واستهدف بنيات الـ RNA في الخلايا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف بنيات الـ RNA وتنظيم وظائف الـ RNA باستخدام PNAS الرابطة لـ RNA مزدوج الشريط. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الـ RNA والأمراض لاستكشاف تطوير العلاجات التي تستهدف بنية الـ RNA.