بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

الهدف العام من سير العمل التكراري هذا الذي يجمع بين التصميم التجريبي القائم على Kringing وتكنولوجيا المفاعل الحيوي الميكروبي لإنتاجية الزراعة الكافية هو وصف نهج عام للتصميم المصمم خصيصا لوسائط الزراعة الميكروبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطوير العمليات الحيوية الميكروبية ، مثل تحسين وسائط الزراعة ، وظروف العملية الحيوية ، بالإضافة إلى التنميط الظاهري للسلالة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما سألنا أنفسنا عما إذا كانت وسائط الزراعة المحسنة لإنتاج المستقلب الصغير هي الأنسب أيضا لإنتاج البروتين غير المتجانس.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسرع أوقات التطوير الإجمالية من خلال الجمع الذكي بين التجربة والنمذجة. سيوضح هذا الإجراء رومان يانسن ، طالب دكتوراه من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بدراسة ومفهوم وتعريف الأساليب كما هو مفصل في بروتوكول النص.

قم بتعقيم ألواح الآبار العميقة لتخزين محلول المخزون على طاولة عمل عن طريق مسح الألواح بنسبة 70 في المائة من الإيثانول ثم تجفيفها لاحقا في غطاء تدفق رقائقي. ابدأ زراعة البذور عن طريق تلقيح 50 مل من وسط BHI الذي يحتوي على 25 ملليغرام لكل لتر من الكاناميسين مع حصة واحدة من بنك الخلايا العاملة. ضع جميع أدوات المختبر اللازمة على طاولة العمل الروبوتية واسكب محاليل المخزون في أدوات المختبر المقابلة.

بعد ذلك ، ابدأ تدفق العمل الآلي لإعداد الوسائط بحيث يتم الوصول إلى الخطوة الأخيرة ، وهي التلقيح ، في الوقت المناسب لبدء زراعة البذور. قم بأخذ عينات من مزرعة البذور بعد ساعتين تقريبا لمراقبة النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر أو OD-600. استمر في مراقبة النمو في كل ساعة.

بعد حوالي خمس ساعات ، تصل المزرعة إلى O-D-600 بين ثلاث وأربع ساعات ، وتستخدم لتلقيح الثقافات الرئيسية. ضع مزرعة البذور على طاولة عمل معالج السوائل واستمر في بروتوكول تحضير الوسائط. أغلق ألواح الميكروتيتر للزراعة بعد التلقيح.

بعد ذلك ، ضع الزراعة المختومة M-T-P في جهاز Biolector. ثم ابدأ بروتوكول الزراعة المحدد مسبقا. تخلص من محاليل المخزون المتبقية وفقا للوائح السلامة الحيوية ، إذا لزم الأمر.

ثم قم بزرع الثقافة من طاولة العمل الآلية. قم بتنظيف أدوات المختبر القابلة لإعادة الاستخدام قبل بدء بروتوكول إزالة التلوث من معالج السوائل. أوقف الثقافة الرئيسية بعد وقت تشغيل مدته 17 ساعة وقم بمعالجة البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

لتحديد عيار G-F-P ، قم أولا بنقل معلقات الخلية من جميع آبار الزراعة إلى أنابيب تفاعل مسبقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء للحصول على طافي خال من الخلية. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من كل مادة طافية خالية من الخلايا إلى بئر أسود 96 M-T-P بقاع شفاف.

اقرأ التألق الخاص ب G-F-P عند 488 نانومتر للإثارة و 520 نانومتر للطول الموجي للانبعاث باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مناسب. بعد قياس مضان G-F-P ، يمكن استخدام الصفيحة الدقيقة مباشرة لتحديد محتوى البروتين في المواد الطافية الخالية من الخلايا باستخدام البروتوكولات القياسية مثل اختبار برادفورد أو BCA. أخيرا ، انتقل إلى تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

يشكل الإجراء المبين جولة واحدة من التجارب ، وتستخدم النتائج لتصميم جولات أخرى مع أقصى قدر من التحسين المتوقع لإشارة G-F-P. يتم وضع التجارب المرجعية في كل جولة لتحليل تباين البيانات والكشف عن القيم المتطرفة التجريبية. يعطي مخطط الكنتور هذا نظرة عامة على إجراء التحسين.

كشف تحليل مجموعة البيانات التي تم جمعها من خلال التكرار الثالث عن وجود قيود على التأثير الإيجابي للمغنيسيوم ، وتحديد نطاق التركيز الأمثل. لذلك تقرر توسيع نطاق التركيز فقط للكالسيوم في التكرار الرابع. تكرر الإجراء مرتين في التكرار الخامس والسادس حتى تم العثور على تشبع لإشارة G-F-P.

يفسر هذا التشبع بترسيب ملح الكالسيوم للتركيزات المطبقة من الكالسيوم ، والتي لا تتوفر للخلية. تم استخدام التكرار السابع لاستكشاف الحدود بمزيد من التفصيل. يمكن تحديد نطاقات التركيز المثلى لمكونات الوسائط لإشارة G-F-P المشبعة بشكل موثوق باستخدام اختبار Z إحصائي.

يظهر الهضبة المحددة كما تم تحديدها وتصورها باستخدام صندوق أدوات مجموعة Kringing. صندوق أدوات Kringing kit متاح مجانا ويأتي مع برنامج تعليمي مفصل يشرح كيفية استخدام ميزاته. تسمح الطبيعة العامة للبروتوكول المقدم بتعديلات مختلفة ، مثل دراسة مضيفي التعبير الميكروبي الآخرين أو تحسين الخصائص الأخرى للبروتين المستهدف ، مثل نمط الارتباط بالجليكوزيل أو روابط ثاني كبريتيد.

يؤدي تكامل نظام embrion إلى زيادة الإنتاجية التجريبية ، مما يتيح توفيرا كبيرا في الوقت عند استبدال المفاعلات الحيوية التي يمكن التحكم فيها بالكامل والمؤثرة بأنظمة السلى ، يجب مراعاة قابلية التوسع في النتائج. تساعد النمذجة الرياضية وتصميم التجارب على تعظيم محتوى المعلومات لبيانات القياس فيما يتعلق بالهدف المدروس.