تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجديد الألواح الإلكترونية التجارية المجهزة لمحلل الخلايا في الوقت الفعلي (Real-Time Cell Analyzer)، أو RTCA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تجديد الرقائق القائمة على الذهب والمعدة للاستخدام مرة واحدة، بما في ذلك تجديد الألواح الإلكترونية المستخدمة في RTCA. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إجراء عملية التجديد باستخدام كواشف مخبرية خفيفة ومتوفرة بسهولة وذات سمية منخفضة.

لقد راودتنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما بدأنا في استخدام جهاز تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (Real-Time Cell Analyzer) الذي يتطلب رقائق قائمة على الذهب بتكلفة عالية. ابدأ هذا الإجراء بحضانة وتكثير خلايا A549 في أطباق زراعة الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي. أضف 150 µL من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر حضانة في اللوحة الإلكترونية L8. اترك اللوحة لمدة 30 دقيقة داخل خزانة السلامة البيولوجية للوصول إلى حالة التوازن.

بعد مرور 30 دقيقة، أدخل يدوياً اللوحة الإلكترونية L8 في جهاز تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (Real-Time Cell Analyzer) الموجود داخل حاضنة CO2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج تشغيل جهاز تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي على الكمبيوتر. في صفحة إعداد نمط التجربة الافتراضية، اختر نمط التجربة (Experiment Model)، ثم قم بتسمية المقايسة الجارية.

في صفحة المخطط، اختر الآبار المقابلة المضمنة في التجربة، وأدخل المعلومات مثل نوع الخلايا، وعددها، وأسماء الأدوية في مربعات التحرير. وفي صفحة الجدول الزمني، أضف الخطوات التجريبية، ثم حدد وقت التشغيل لكل خطوة والفاصل الزمني لاكتساب البيانات في الوقت الفعلي. انقر فوق "بدء" لقياس الممانعة الخلفية للوسط.

سيتم حفظ ملف التجربة. كما ستُطرح البيانات الناتجة تلقائيًا. وفي صفحة المخطط، أضف الآبار، وسيظهر الرسم البياني لمؤشر الخلية بمرور الوقت.

بالنسبة لتجربة تكاثر الخلايا، انقر أولاً على زر الإيقاف المؤقت لإيقاف البرنامج مؤقتاً. ثم أخرج اللوح الإلكتروني، وأضف 100 µL من محلول منظم تعليق خلايا A549 في كل بئر في درجة حرارة الغرفة. اترك اللوح لمدة 30 دقيقة داخل خزانة السلامة البيولوجية للسماح للخلايا بالترسب في قاع آبار الحضن.

أدخل اللوحة الإلكترونية يدويًا في محطة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي. ثم انقر على زر البدء لمتابعة التجربة. وفي صفحة المخطط البياني، يقوم المحلل بتسجيل قيم مؤشر الخلايا، أو المنحنيات، بشكل مستمر طوال فترة التجربة.

عند اكتمال التجربة، ادخل إلى صفحة المخطط البياني، وافتح ملف التجربة. ثم حدد جميع آبار الحضن المختبرة ومنحنيات مؤشر الخلايا الناتجة التي يمكن حساب متوسطها أو تسويتها للمرة الأخيرة قبل إضافة العقاقير الدوائية أو تغيير الوسط لتقليل التباينات بين المقاييس. وفي صفحة تحليل البيانات، يمكن حساب EC50 أو IC50.

بعد إجراء تقييم السمية الخلوية للعقار المضاد للسرطان كما هو موضح في البروتوكول النصي، أخرج اللوحة الإلكترونية التي تحتوي على الخلايا من محطة تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (Real-Time Cell Analyzer). ضع اللوحة الإلكترونية المستخدمة في غطاء أمان حيوي معقم في درجة حرارة الغرفة، واخلط وسط الزرع جيدًا باستخدام الماصة. بعد ذلك، استخدم الماصة لسحب الوسط بالكامل.

اشطف الألواح الإلكترونية بـ 200 µL من الماء منزوع الأيونات ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة. قم بهضم الخلايا المتبقية على الألواح الإلكترونية باستخدام trypsin مُحضّر حديثاً بتركيز 0.25% لمدة تتراوح بين ساعة وساعتين في حضانة عند 37 °C. عند اكتمال عملية الهضم، اعمل داخل غطاء السلامة البيولوجية في درجة حرارة الغرفة لخلط محلول الحضن من 5 إلى 10 مرات باستخدام الماصة، ثم قم بإزالة المحلول.

اشطف الألواح الإلكترونية بـ 200 µL من الماء منزوع الأيونات مرتين. ثم اغسلها بـ 200 µL من الإيثانول بتركيز 100% مرتين، يليه نفس الحجم من الإيثانول بتركيز 75% مرتين. وأخيراً، اشطفها بـ 200 µL أخرى من الماء منزوع الأيونات مرتين.

اقلب اللوحة الإلكترونية على شاش معقم أو ورق مناديل لتصريف المياه المتبقية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية على اللوحة الإلكترونية المجددة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين داخل غطاء السلامة البيولوجية في درجة حرارة الغرفة. بعد استخدام اللوحات لإيصال الدواء باستخدام مادة مسامية متوسطة كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بهضم الخلايا المتبقية باستخدام التربسين كما سبق.

نظراً لاستخدام الماصة بشكل متكرر في التجارب، يجب على الشخص توخي الحذر لتجنب خدش الطرف وسطح الرقاقات الدقيقة. اشطف الرقاقات الدقيقة بـ 200 microliters من الماء منزوع الأيونات مرة واحدة داخل غطاء السلامة الحيوية في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطف الرقاقات الدقيقة بـ 200 microliters من الإيثانول المطلق مرتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اشطف الرقائق الدقيقة بـ 200 µL من الإيثانول بتركيز 75% لمرة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف 250 µL من الإيثانول بتركيز 75% في كل بئر، ثم أغلق اللوحة الإلكترونية باستخدام غشاء الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. بعد تدوير اللوحة الإلكترونية بسرعة 114 ×g لمدة دقيقتين، قم بتفريغ اللوحة.

اقلب اللوحة الإلكترونية على شاش معقمة أو ورق مناديل لتصريف السائل المتبقي في درجة حرارة الغرفة. كرر عمليات الشطف بـ 75%ethanol المتبوعة بالدوران. بعد ذلك، قم بإجراء التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية للوحة الإلكترونية المجددة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين داخل غطاء السلامة البيولوجية في درجة حرارة الغرفة.

قم بتقييم الخصائص البصرية لسطح اللوحة الإلكترونية المجددة من خلال تفكيك الجزء السفلي من بئر الحضن أولاً كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولتقييم حيوية الخلايا الملتصقة بعد امتصاص الدواء المضاد للسرطان على اللوحات الإلكترونية الجديدة والمجددة، استخدم مجهر المسح الليزري البؤري لمراقبة الفلورة التلقائية لجزيئات DOX التي امتصتها خلايا A549. ولتسجيل الفلورة التلقائية لـ DOX الممتص بواسطة الخلايا، استخدم عدسة زيتية بقوة تكبير 63 مرة وطول موجي للإثارة يبلغ 485 nanometers.

بعد ذلك، يتم تقييم السلوكيات الكهركيميائية للأقطاب المجددة من خلال صقل القطب الذهبي وقطب الكربون الزجاجي أولاً للوصول إلى سطح مصقول كالمرآة باستخدام ملاط تلميع على قطعة قماش صقل. ثم تُوضع الأقطاب في جهاز الموجات فوق الصوتية في الماء لإزالة أي جزيئات. بعد ذلك، يتم تنشيط القطب الذهبي في حمض الكبريتيك بتركيز 0.5-molar.

احصل على بيانات مطيافية الممانعة الكهركيميائية، أو بيانات EIS، للقطب الذهبي العاري وقطب الكربون الزجاجي في محلول إلكتروليت كلوريد البوتاسيوم بتركيز 10 mM، والذي يحتوي على 1 mM من فيروسيانيد البوتاسيوم. الآن، ضع 10 µL من معلق خلوي على سطح القطب الذهبي في GCE. بعد إضافة الخلايا، قم بتحضين القطب الذهبي في GCE في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ثلاث ساعات قبل الحصول على بيانات EIS للأقطاب المعدلة بالخلايا، كما هو موضح في البروتوكول النصي.

لإعادة تنشيط الأقطاب الكهربائية، اغمر القطب الذهبي والقطب GCE المعدل بالخلايا في trypsin بتركيز 0.25% لمدة تتراوح من 0.5 إلى ساعتين. اشطف كلا القطبين بلطف بالماء أربع مرات، ثم اشطف الأقطاب بلطف بالإيثانول المطلق أربع مرات.

بعد ذلك، اغمر القطب الذهبي في GCE في إيثانول بتركيز 75% لمدة خمس دقائق تقريباً. وبعد مرور خمس دقائق، اشطف الشريحة بلطف باستخدام إيثانول بتركيز 75% أربع مرات قبل الحصول على بيانات EIS للأقطاب المجددة، كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولتقييم كفاءة تجديد اللوحة الإلكترونية الذهبية المصفوفة، أُجريت ملاحظات مجهرية لكل من اللوحات الإلكترونية الجديدة والمعالجة.

لم يتم العثور على فرق فعلي في الخواص البصرية لسطح الرقاقة الدقيقة. استُخدم تألق جزيئات الدوكسوروبيسين (doxorubicin) لتقييم حالة الخلايا على الرقاقات الدقيقة الذهبية قبل التجديد وبعده. وقد أظهر التجانس المماثل والمورفولوجيا الخلوية محددة المعالم إمكانية إعادة استخدام الرقاقات.

يُطبق بروتوكول التجديد لإجراء الاختبار الفعلي لتكاثر الخلايا. وتُظهر منحنيات النمو التي تم الحصول عليها من آبار حضانة متعددة في لوحة إلكترونية مختبرة اتساقاً جيداً، مما يشير إلى نجاح تجديد الشريحة التجارية. وموضح هنا، تم اختبار اللوحة الإلكترونية المجددة L8 لتقييم السمية الخلوية باستخدام مواد السيليكا المسامية المتوسطة.

انخفض مؤشر الخلايا في العينة المعالجة بالمواد مسامية المسام مقارنة بالمجموعة الضابطة، مما يشير إلى سمية خلوية طفيفة لهذه المواد. وأدى التغليف اللاحق للدواء المضاد للسرطان doxorubicin وإطلاقه بواسطة المواد مسامية المسام إلى انخفاض حاد في منحنى نمو خلايا A549. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن وقت هضم المصب من النوع (type sink) قد يختلف من شريحة إلى أخرى. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر البؤري الماسح بالليزر، أو حتى المطيافية، أو مطيافية الممانعة الكهروكيميائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل تقييم تأثير التجديد.