RGB والتصوير الطيفي الجذر فينوتيبينج النباتية والبحوث الفسيولوجية: الإعداد التجريبية والتصوير البروتوكولات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على معلومات شاملة عن جذور النباتات التي تنمو في صناديق جذورية (rhizoboxes) مملوءة بالتربة من خلال الجمع بين طرق تصوير مختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التنميط الظاهري للنباتات وتربيتها، مثل مدى مساهمة البنى الجذرية المختلفة في تحسين مقاومة الإجهاد غير الحيوي. تكمن الميزة الرئيسية لهذا النهج في أنه يجمع بين التصوير بنظام RGB لدراسة بنية الجذور والتصوير فرط الطيفي لدراسة الوظائف الجذرية.

تمتد إمكانات استخدام التصوير الفرط طيفي للجذور لتشمل مجموعة واسعة من معاملات منطقة الريزوسفير، حيث يمكن للمعلومات الطيفية أن تكشف عن التغيرات الفيزيائية والكيميائية صغيرة النطاق التي تسببها جذور النباتات. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يجب تنفيذ خطوات ملء صندوق الريزوبوكس بعناية؛ وإلا سيتأثر نمو الجذور ومدى رؤيتها سلباً.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز صناديق الجذور (rhizoboxes) لملئها بالركيزة كما هو مفصل في البروتوكول النصي. قم بترطيب التربة الجافة مسبقاً حتى يصل المحتوى المائي الوزني إلى 0.108 جرام لكل جرام عن طريق إضافة 400 جرام من الماء لكل 3,705 جرام من التربة الجافة. اخلط التربة والماء برفق للحصول على توزيع متجانس للمياه.

قم بتفكيك التجمعات الكبيرة يدويًا للحفاظ على حجم الجزيئات أصغر من أو يساوي 2 mm. من الضروري الحصول على طبقة متجانسة من التربة بجوار نافذة مراقبة الغاز مع تجنب وجود فجوات هوائية، حيث تجف أطراف جذور النباتات بسرعة عند نموها داخل الفجوات الهوائية.

كما تتأثر جودة الصور الطيفية لرسم خرائط المياه سلبًا. املأ صناديق الريزوبوكس المفتوحة بالتربة المبللة مسبقًا، وقم بدمكها برفق باستخدام ورقة بوليسترين لتغطية الحجم الداخلي للصندوق، مما يؤدي إلى كثافة ظاهرة متجانسة تبلغ 1.3 grams per cubic centimeter. أضف الكمية المتبقية من الماء لتحقيق محتوى الماء المستهدف وهو 0.31 cubic centimeters per cubic centimeter عن طريق الرش على السطح باستخدام زجاجة بخاخ.

تأكد من صغر حجم القطرة لتجنب تدهور البنية السطحية، ولضمان ترطيب متجانس. أبقِ الصندوق على الميزان أثناء الرش لمراقبة كمية المياه المضافة فعلياً إلى الركيزة. اترك الماء ليعيد التوزع لمدة 10 دقائق، ثم اضغط الزجاج على السطح وثبته باستخدام السكك المعدنية الجانبية.

بلغ متوسط الوزن النهائي لصناديق الجذور ذات الركيزة المبللة 17,818 ± 68 جراماً. قم بتجهيز غرفة المناخ بثمانية مصابيح LED توفر إضاءة متجانسة بمقدار 450 micromoles per square meter per second مع ذروات طيفية عند 440 و660 nanometers لتحقيق النمو الأمثل للنبات. بعد ضبط المعايير المحيطة وفقاً لاحتياجات النبات والتجربة، قم بتغطية النافذة الزجاجية بلوح خشبي لإبقاء منطقة الجذور في الظلام وتجنب نمو الطحالب الناتج عن نفاذ الضوء عبر السطح الزجاجي.

بعد ذلك، ضع صناديق الجذور (rhizoboxes) بزاوية ميل قدرها 45 درجة باستخدام إطار معدني مناسب. يهدف ذلك إلى زيادة نمو الجذور نحو السطح الزجاجي بفعل الانتحاء الأرضي. ولتصوير الجذور بنظام RGB، قم بإضاءة صندوق الجذور باستخدام أربعة أنابيب إضاءة فلورسنت بقدرة 24 وات مثبتة على مسافة 80 سنتيمتر من صندوق الجذور.

قم أيضًا بتركيب أربعة أنابيب UV بقدرة 15 واط على بُعد 20 سنتيمتر من الإضاءة البديلة لصندوق الجذور (rhizobox)، وذلك للاستفادة من الفلورة الذاتية للجذور في حال كان التباين منخفضًا بين الجذر وخلفية الركيزة فاتحة اللون. قم بتشغيل مصابيح UV ثم ضع صندوق الجذور المراد تصويره في حامل صندوق التصوير. بعد ذلك، التقط صورتين لتغطية النصفين العلوي والسفلي من صندوق الجذور مع وجود تداخل يبلغ حوالي ثلاثة سنتيمترات.

قم بالتقاط ومعالجة صور RBG كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول النصي. أخيراً، قم بإجراء تحليل لصور جذور RBG التي تم التقاطها، ثم تحقق فيما إذا كانت هناك مناطق غير متطابقة. وفي هذه الحالة، قم بتحديد منطقة استبعاد وأعد تشغيل التحليل.

بالنسبة للجذور غير المصنفة، أضف فئات لونية إضافية وأعد تشغيل التحليل. أما بالنسبة للعناصر التي تم تصنيفها بشكل خاطئ كجذور، فقم بتنشيط أو زيادة خيارات تصفية الحطام والحواف الخشنة. قم بإجراء عملية الحصول على الصور من خلال تحديد أوقات تكامل الكاميرا لمسح الـ rhizobox والمعيار الأبيض في برنامج الكاميرا أولاً.

للقيام بذلك، افتح واجهة المستخدم الرسومية للتصوير وحرك الكاميرا إلى موضع في صندوق الجذور (rhizobox) حيث توجد الجذور. اضبط وقت التكامل (integration time) للكاميرا مع استهداف جسم مضيء بطريقة يتم فيها استخدام ما يقرب من 85% من النطاق الديناميكي الكامل للكاميرا على المدرج التكراري (histogram) الذي يعرضه البرنامج. يعد ضبط وقت التكامل بشكل صحيح لمختلف الركائز وأنسجة الجذور أمراً بالغ الأهمية للاستفادة الكاملة من النطاق الديناميكي لكاميرا الأشعة تحت الحمراء، وذلك لتجنب أي فقدان للمعلومات نتيجة تجاوز نطاقها.

كرر العملية للمعيار الأبيض عن طريق نقل نظام تحديد موضع الكاميرا لاستهداف المعيار الأبيض قبل إغلاق برنامج الكاميرا. بعد ذلك، افتح واجهة المستخدم الرسومية للتصوير في Matlab وأدخل جميع الإعدادات من مسح rhizobox الحالي. احصل على المعايير المظلمة والبيضاء قبل كل جولة تصوير مرة واحدة يومياً.

يمثل المعيار المظلم ضوضاء الكاميرا، بينما يعطي المعيار الأبيض أقصى درجة انعكاس. هذه البيانات مطلوبة لمعايرة الصور أثناء المعالجة المسبقة. حدد ما إذا كان سيتم مسح صندوق الجذور (rhizobox) بالكامل أو جزء منه فقط.

في الحالة الراهنة، يتم تصوير صناديق الجذور (rhizoboxes) بأكملها. ثم ابدأ عملية المسح. ولإجراء قياس لمحتوى الماء بناءً على الطيف، يلزم توفر صندوق جذور للمعايرة.

قسّم صندوق الجذور (rhizobox) إلى مقصورات بطول خمسة سنتيمترات باستخدام ألواح البوليسترين لملئها بتربة ذات محتويات مائية مختلفة. قم بمسح صندوق جذور المعايرة بنفس الإعدادات المستخدمة لصناديق الجذور المزروعة. على سبيل المثال، للجمع بين سمات الجذور والسمات فوق سطح الأرض، أحضر جهاز قياس مسامية الأوراق (leaf porometer) لقياس الموصلية الثغرية.

قم بموازنة الجهاز مع الظروف المحيطة لمدة ساعة واحدة على الأقل في غرفة المناخ. خذ قياسات من ثلاث أوراق على الأقل لكل نبات. تظهر هنا صورة تمثيلية لنمو جذور صنف بنجر السكر، Ferrara، بناءً على تصوير RGB.

بعد 35 يوماً من الزراعة، تكون جذور النبات قد استطالت لتصل إلى قاع صندوق الجذور (rhizobox). ولم يكن من الممكن تقسيم بعض محاور الجذور عند الجزء العلوي من صندوق الجذور من خلال صور RGB. كما يؤدي شيخوخة الجذور القاعدية الأقدم إلى تغير لونها إلى البني.

وبناءً على ذلك، فإن عملية الفصل بين هذه الجذور وخلفية التربة استناداً إلى عتبة لونية تعتبر غير مجدية. وباستخدام التصوير فرط الطيفي، تعتمد عملية التجزئة على الميزات الطيفية المختلفة لكل من مقدمة الجذور وخلفية التربة، مما يؤدي إلى تحسين نتيجة التجزئة.

لا تتجاوز الفروق في طول الجذر المقاس مقارنة بصورة مرجعية تم تتبعها يدويًا نسبة 1.5%. علاوة على ذلك، يتيح التصوير الطيفي رسم خرائط دقيقة لمحتوى الماء حول الجذر للاستدلال على امتصاص الماء. يظهر هنا الهيكل العظمي للجذر باللون الأسود، بينما تشير المناطق الفاتحة إلى مناطق ذات استنزاف مائي أعلى بالقرب من محاور الجذور.

بينما تمثل المناطق ذات اللون الأزرق الداكن المناطق التي تحتوي على محتوى مائي أعلى في التربة خارج نطاق وصول الجذور. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ملء صناديق الريزوبوكس (rhizoboxes) بشكل صحيح لضمان نمو الجذور ورؤيتها بشكل مرضٍ. وهذا يمثل الأساس لعمليات التصوير اللاحقة والحصول على نتائج تمثيلية لتنميط الجذور المظهري.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى للتصنيف الطيفي مثل تجميع K-means أو آلات متجه الدعم (support vector machines) للحصول على معلومات متعمقة حول خصائص الجذور ومنطقة الريزوسفير، مثل شيخوخة الجذور وتحللها. وبمجرد ترسيخ هذه التقنية، ستتيح لك التوصيف المظهري الشامل لأنظمة الجذور والاستجابة للإجهاد غير الحيوي. ويمكن توصيف مجموعة مكونة من 10 أصناف في مدة تجريبية إجمالية تقل عن ثلاثة أشهر.