كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) خالية من الآثار الجينية من خلايا بنكرياسية بشرية في ظروف خالية من الخلايا المغذية، ثم تعديل هذه الخلايا باستخدام البروتينات النووية الريبوزية CRISPR-Cas9، وأخيراً توصيف النسائل أحادية الخلية المعدلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تحرير جينوم الخلايا الجذعية البشرية، مثل توليد خلايا iPSCs خالية من الآثار الجينية والتعديل باستخدام البروتينات النووية الريبوزية CRISPR-Cas9. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية توليد خطوط نسيلية من خلايا iPSCs المعدلة بموثوقية عالية، مع عدم وجود دليل على حدوث الفسيفسائية الجينية.

بعد طلاء طبق سداسي الفجوات بالكولاجين البارد، يتم زرع خلايا بنكرياسية بشرية أولية في مراحل عبور مبكرة في وسط Prigrow III في اليوم الثاني لتحقيق حوالي 2.5 x 10⁵ خلية أو نسبة تلاحم لا تقل عن 60% لكل فجوة في يوم نقل الجينات أو اليوم صفر. وفي يوم نقل الجينات، وبعد حصاد الخلايا وعدّها وفقاً للبروتوكول النصي، يتم إذابة مجموعة واحدة من أنابيب ناقل Sendai على الثلج، ثم تُضاف بعناية الأحجام المحسوبة من كل أنبوبة إلى 1 mL من وسط Prigrow III المُدفأ مسبقاً. ويُخلط المحلول بلطف باستخدام الماصة.

قم بشفط وسط Prigrow III من الخلايا وأضف ببطء خليط فيروسات إعادة البرمجة إلى الآبار. بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. وبعد أربع وعشرين ساعة من عملية التنبيغ، تخلص بعناية من خليط الفيروسات الموجود فوق الخلايا واستبدله بوسط Prigrow III جديد.

في اليوم السادس، أضف 1 mL من محلول فصل الخلايا إلى الخلايا واتركها في الحضانة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، وباستخدام Prigrow III مع مثبط ROCK، قم بنشر جميع الخلايا في أطباق من خلايا MEFs التي تم تحضيرها في اليوم السابق. احضن الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

راقب الأطباق بانتظام لظهور تكتلات خلوية أو مستعمرات تشير إلى الخلايا المعاد برمجة، والتي ستشكل تجمعات نسيلية ذات مورفولوجيا تشبه رصف الحجارة ونواة ونويات كبيرة. قم بتمييز مستعمرات IPSC المحتملة وتحقق من نموها بانتظام. بعد مرور ما يقرب من أربعة أسابيع على عملية ترانسدكشن وبعد تحضير أطباق MEF ذات الـ 24 بئرًا، قم بتحضير غشاء الماتريكس عن طريق توزيع كميات منه بناءً على عامل التخفيف المذكور في شهادة التحليل.

اختر من 24-48 مستعمرة وانقلها إلى أطباق ذات 24 بئرًا مغطاة بغشاء مصفوفة (matrix membrane) تحتوي على mTeSR1. يتم تحضين الأطباق لمدة 24 ساعة مع تغيير الوسط الغذائي يوميًا. يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب للحصول على تفاصيل إضافية.

أضف 500 mcL من إنزيم dispase لفصل المستعمرات القوية المزروعة على غشاء المصفوفة. بعد تحضين الخلايا لمدة 20 دقيقة، قم بزراعتها مرة أخرى في أطباق ذات 12 بئراً مغطاة بغشاء المصفوفة. قم بتكثير المستنسخات وتوصيفها باستخدام صبغ الفوسفاتاز القلوي، والصبغ المناعي، وتحليل FACS وفقاً للبروتوكول المكتوب.

لإجراء عملية عفن (transfection) لخلايا HIPSCs بعد تخليق SGRNAs وفقاً لبروتوكول النص، قم بتحضير المزيج الرئيسي للـ nucleofaction لكل عينة عن طريق دمج 0.5 mcg من بروتين Cas9 و 0.5 mcg من كل SGRNA في حجم تفاعل قدره 22 mcL. بعد سحب الوسط الذي يحتوي على مثبط الروك (rock inhibitor)، استخدم 2 mL من RTPBS لغسل كل بئر من خلايا ISPCs. ثم اسحب PBS وأضف 1 mL من محلول فصل الخلايا.

يُحضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تُعاد معلقة الخلايا في 3 mL من وسط mTeSR1، مع السحب والضخ بلطف باستخدام الماصة للحصول على معلق من الخلايا المفردة. تُنقل الخلايا المفككة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL يحتوي على 5 mL من وسط mTeSR1.

أضف إلى المزيج الرئيسي للنقل النووي 16.4 mcL من مكمل الخلايا الأولية P3 و 3.6 mcL من المكمل الأول من مجموعة Nucleofector. بعد عد الخلايا وطردها مركزياً، أعد تعليق كل وحدة مكونة من 0.5 x 10⁶ خلية في 22 mcL من المزيج الرئيسي للنقل الذي تم تحضيره مسبقاً. انقل الخلايا بسرعة إلى الغرفة المركزية لبئر واحد من شريط Nucleocuvette.

بعد ذلك، ضع الشريط في جهاز Nucleofector وقم بإجراء عملية النقل النووي للخلايا باستخدام البرنامج CB150. وعقب عملية النقل النووي، أضف بسرعة 80 mcL من وسط mTeSR1 المُدفأ مسبقاً والذي يحتوي على 10 micromolar من مُثبط rock إلى كل بئر من آبار الخلايا التي خضعت للنقل النووي. اخلط المزيج بلطف عن طريق السحب والدفع بالمصّة.

انقل الخلايا برفق من الشريط إلى آبار صفيحة ذات 12 بئراً مطلية مسبقاً بغشاء مصفوفي تحتوي على وسط mTeSR1 مع مثبط rock. وفي اليوم الثاني من الحضن بعد تحضير صفائح MEF، استبدل الوسط المستخدم لـ HIPSCs من mTeSR1 إلى mTeSR1 مضاف إليه 1XSMC4 لمدة ساعتين على الأقل قبل فرز الخلايا المفردة. اشفط الوسط من HIPSCs واستخدم PBS لغسل الخلايا برفق.

بعد ذلك، أضف 500 mcL من محلول فصل الخلايا إلى كل بئر، واحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإعداد معلق من الخلايا المفردة عن طريق إضافة 1 mL من mTeSR1 إلى كل بئر، ثم اسحب السائل وأطلقه برفق باستخدام الماصة عدة مرات. قم بفرز الخلايا المفردة وتوزيعها في آبار فردية من طبق 96 بئر قد تم تحضيره مسبقاً.

بعد مرور أربعة أيام من الفرز، يجب أن يكون تكوين المستعمرات واضحاً. عند هذه النقطة، استبدل الوسط الزرعي بوسط HESC المكمل بـ 1X SMC4. بعد استخراج وتوسيع الحمض النووي المستهدف وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم مجموعة تحليل القطع (fragment analyzer kit) لتشغيل المنطقة الجينومية المستهدفة المضخمة بواسطة PCR لجميع المستنسخات عبر خليط صبغة الهلام (gel dye mix) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتأكيد مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (IPSC) وفقاً للبروتوكول النصي. تظهر الخلايا البنكرياسية شكلاً مورفولوجياً مغزلياً نموذجياً قبل ترنسدكشن فيروس سينداي. وتظهر مستعمرات صغيرة متراصة على الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) بحلول اليوم 12، تشبه مستعمرات الخلايا البشرية متعددة القدرات.

عادةً ما تمتلك مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية المحفزة وافرة القدرة (IPSC) المعاد برمجهَا بالكامل حدوداً واضحة جداً ويمكن التقاطها في الفترة ما بين اليوم 23 واليوم 30. تظهر هنا مستعمرة منفصلة في اليوم 23. كما تُعرض هنا صورة نموذجية بتباين الطور لمستعمرة IPSC بعد الالتقاط والزراعة في ظروف خالية من الخلايا المغذية بعد إعادة برمجة خلايا البنكرياس باستخدام فيروس سنداي.

تظهر مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (IPSC) المصبوغة باللون الأحمر للفوسفاتاز القلوي على اليمين. وقد تم تأكيد الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (IPSCs) عن طريق التلوين المناعي لعلامات تعدد القدرات OCT4 وNANOG كما هو موضح في هذه اللوحات. وفي هذه التجربة، صُبغت الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (IPSCs) بعلامات سطح الخلية، وأجري تحليل FACS على معلق من الخلايا المفردة.

تمثل القمة الخضراء الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) البنكرياسية، بينما تحتوي القمة الأرجوانية على الخلايا السالبة لـ iPSC. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على ظروف معقمة لفرز الخلايا وزراعتها. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل استهداف الجينات في iPSCs و ESCs، كما يمكن الإجابة على أسئلة إضافية من خلال إجراء تعديلات جينية دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بشكل موثوق، بحيث تكون خالية من البصمات الوراثية وخالية من الخلايا المغذية، وكيفية إجراء تحرير جينومي ثنائي الأليل.