كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

بروتوكول يصف بالتفصيل جيل خال من البصمة المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، تبع هذا التحرير باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر/Cas9 وتوصيف لتعديل استنساخ الخلايا المفردة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات أو IPSCs من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من المغذيات ، ثم تحرير الخلايا باستخدام البروتينات النووية الريبية CRISPR-Cas9 وأخيرا توصيف المستنسخة من خلية واحدة المعدلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تحرير جينوم الخلايا الجذعية البشرية مثل توليد IPSCs الخالية من البصمة والتحرير باستخدام البروتينات النووية الريبية CRISPR-Cas9. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء خطوط نسلية من IPSCs المعدلة بموثوقية عالية ولا يوجد دليل على الفسيفساء.

بعد طلاء صفيحة من ستة آبار بالكولاجين البارد ، قم بالمرور المبكر لخلايا البنكرياس الأولية البشرية في وسط Prigrow III في اليوم 2 لتحقيق ما يقرب من 2.5 × 10 إلى 5 خلايا أو ما لا يقل عن 60٪ التقاء لكل بئر في يوم التنبيغ أو اليوم صفر. في يوم التنبيغ بعد حصاد الخلايا وعدها وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة الجليد مجموعة واحدة من أنابيب ناقلات Sendai على الجليد وأضف بعناية الأحجام المحسوبة لكل أنبوب إلى 1 مل من وسط Prigrow III الدافئ مسبقا. ماصة برفق لخلط المحلول.

استنشق Prigrow III من الخلايا وأضف ببطء خليط الفيروسات المعاد برمجته إلى الآبار. ثم احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد أربع وعشرين ساعة من التنبيغ ، تخلص بعناية من خليط الفيروس على الخلايا واستبدله بوسط Prigrow III الطازج.

في اليوم السادس، أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى الخلايا واحتضانها لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، باستخدام Prigrow III مع مثبط الصخور ، قم بوضع جميع الخلايا على أطباق MEFs المحضرة في اليوم السابق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

راقب الصفائح بانتظام بحثا عن ظهور كتل أو مستعمرات للخلايا المعاد برمجتها والتي ستشكل مجاميع نسيلة مع مورفولوجيا مرصوفة بالحصى ونواة كبيرة ونواة. ضع علامة على مستعمرات IPSC المحتملة وتحقق منها بانتظام للتأكد من نموها. بعد أربعة أسابيع تقريبا من التنبيغ بعد تحضير 24 لوحة MEF بئر ، قم بإعداد غشاء المصفوفة عن طريق اقتباسه بناء على عامل التخفيف في شهادة التحليل.

اختر 24-48 مستعمرة وانقلها إلى غشاء مصفوفة مطلي ب 24 لوح بئر باستخدام mTeSR1. احتضن الألواح لمدة 24 ساعة وقم بتغيير الوسيط كل يوم. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية.

أضف 500 مل لتر من التباعد لفصل المستعمرات القوية المطلية على غشاء المصفوفة. بعد احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة ، قم بوضعها مرة أخرى على غشاء مصفوفة مطلي ب 12 لوحة بئر. قم بتوسيع وتوصيف المستنسخة باستخدام تلطيخ الفوسفاتيز القلوي والتلوين المناعي وتحليل FACS وفقا لبروتوكول النص.

لنقل HIPSCs بعد تصنيع SGRNAs وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد مزيج kernelofaction الرئيسي لكل عينة عن طريق الجمع بين 0.5 ميكروغرام من بروتين Cas9 و 0.5 ميكروغرام من كل SGRNA في حجم تفاعل 22 ملليتر. بعد شفط الوسط الذي يحتوي على مثبط الصخور ، استخدم 2 مل من RTPBS لغسل كل بئر من ISPCs. ثم استنشق PBS وأضف 1 مل من محلول انفصال الخلية.

احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط mTeSR1 وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتوليد معلق خلية واحدة. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط mTeSR1.

إلى المزيج الرئيسي للنواة ، أضف 16.4 مللي لتر من مكمل الخلية الأولية P3 و 3.6 مللي لتر من المكمل الأول من مجموعة Nucleofector. بعد عد الخلايا وتدويرها ، أعد تعليق كل وحدة من 0.5 × 10 إلى الخلايا السادسة في 22 مللي لتر من مزيج التعداء الرئيسي المعد مسبقا. انقل الخلايا بسرعة إلى الغرفة المركزية لبئر واحد من شريط Nucleocuvette.

بعد ذلك ، ضع الشريط في جهاز Nucleofector وقم بتوصيل الخلايا باستخدام برنامج CB150. بعد النواة ، أضف بسرعة 80 مللي لتر من وسط mTeSR1 الدافئ مسبقا الذي يحتوي على 10 مثبطات صخورية ميكرومولار إلى كل بئر من الخلايا النووية المجمعة. امزج برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

انقل الخلايا برفق من الشريط إلى آبار غشاء المصفوفة المطلي مسبقا ب 12 لوحة بئر تحتوي على وسط mTeSR1 مع مثبط الصخور. في اليوم الثاني من الحضانة بعد تحضير ألواح MEF ، استبدل الوسط الموجود على HIPSCs من mTeSR1 إلى mTeSR1 المكمل ب 1XSMC4 لمدة ساعتين على الأقل قبل الفرز أحادي الخلية. استنشق الوسط من HIPSCs واستخدم PBS لغسل الخلايا برفق.

ثم أضف 500 مل لتر من محلول انفصال الخلايا في كل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإنشاء معلق أحادي الخلية عن طريق إضافة 1 مل من mTeSR1 إلى كل بئر وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. قم بفرز الخلايا المفردة في آبار فردية من لوحة 96 بئر معدة مسبقا.

بعد أربعة أيام من الفرز ، يجب أن يكون تكوين المستعمرة واضحا. في هذه المرحلة ، استبدل وسط الاستزراع بوسط HESC مكمل ب 1X SMC4. بعد استخراج الحمض النووي المستهدف وتوسيعه وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مجموعة محلل الأجزاء لتشغيل المنطقة الجينومية المستهدفة المضخمة ب PCR لجميع المستنسخة من خلال مزيج صبغة الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتأكيد استنساخ IPSC متعدد القدرات وفقا لبروتوكول النص. قبل نقل فيروس سينداي ، تظهر خلايا البنكرياس مورفولوجيا نموذجية تشبه المغزل. تظهر مستعمرات ضيقة صغيرة على MEFs بحلول اليوم 12 تشبه مستعمرات الخلايا البشرية متعددة القدرات.

عادة ما يكون لمستعمرات IPSC البشرية المعاد برمجتها بالكامل حدود واضحة جدا ويمكن التقاطها من 23 إلى 30 يوما. تظهر هنا مستعمرة منفصلة في اليوم 23. معروضة هنا صورة تباين طور نموذجية لمستعمرة IPSC بعد الانتقاء والزراعة في ظروف خالية من المغذيات بعد إعادة برمجة فيروس سينداي لخلايا البنكرياس.

مستعمرات IPSC الحمراء الملطخة بالفوسفاتيز القلوي على اليمين. تم تأكيد IPSCs عن طريق التلوين المناعي لعلامات تعدد القدرات OCT4 و NANOG كما هو موضح في هذه اللوحات. في هذه التجربة ، تم تلطيخ IPSCs بعلامات سطح الخلية وتم إجراء تحليل FACS على معلق خلية واحدة.

تمثل الذروة الخضراء IPSCs في البنكرياس ، وتحتوي الذروة الأرجوانية على خلايا سالبة IPSC. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على ظروف معقمة أو معقمة لفرز الخلايا وزراعة الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل استهداف الجينات في IPSCs و ESCs ، ويمكن الإجابة على أسئلة إضافية من خلال إجراء تعديلات جينية دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء IPSCs خالية من البصمات وخالية من المغذيات بشكل موثوق وإجراء تحرير الجينوم ثنائي الأليل.