بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء مكتبات دليل شامل للحمض النووي الريبي من الحمض النووي المنقى من أي مصدر. مكتبات gRNA هي مجموعات بلازميد تستخدم في الشاشات المستندة إلى كريسبر. تستخدم طريقة CORALINA الهضم الأنزيمي للحمض النووي المنقى لاستنساخ الأجزاء الناتجة في العمود الفقري لمكتبة الحمض النووي الريبي الإرشادية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج جميع الحمض النووي الريبي الإرشادي الممكنة من تسلسل الإدخال وهي فعالة للغاية من حيث التكلفة. على الرغم من أن هذا الفيديو يوضح حماية مكتبة CORALINA من الكروموسوم الاصطناعي البكتيري ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة من حيث المبدأ على أي نوع من الحمض النووي المدخل من أي كائن حي. يجب إجراء تحسين هضم نوكلياز المكورات الدقيقة لكل دفعة جديدة من نوكلياز المكورات الدقيقة.

قم بإعداد ما يلي لكل تفاعل. ميكرولتر واحد من 10x عازلة نوكلياز المكورات الدقيقة ، 1x ألبومين مصل البقر ، ميكروغرام واحد من الحمض النووي المستهدف ، ميكرولتر واحد من نوكلياز المكورات الدقيقة والماء إلى 10 ميكرولترات. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بتعطيل الإنزيم على الفور عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من 500 مللي مولار EGTA. أضف عينة عازلة مع صبغة تحميل هلام إلى عينات الحمض النووي وقم بتحميل ميكروغرام واحد من الحمض النووي لكل بئر في هلام بولي أكريلاميد 20٪. قم بتحميل سلم الحمض النووي المناسب للتحجيم.

قم بتشغيل الجل في 1x TBE تشغيل عازل عند 150 فولت لمدة 1.5 ساعة تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة السفلية إلى الطرف السفلي من الجل. قم بتلطيخ الجل باستخدام بقعة الحمض النووي فائقة الحساسية وتخيلها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في هذا المثال ، كان التركيز الأمثل لنوكلاز المكورات الدقيقة لهضم الحمض النووي حتى 20 إلى 30 زوجا أساسيا في الحجم 10 وحدات.

استخدم هذا التركيز الأمثل من نوكلياز المكورات الدقيقة لهضم 10 إلى 12 ميكروغراما من الحمض النووي المستهدف بنفس الطريقة الموضحة لتفاعلات التحسين. بعد فصل شظايا الحمض النووي بواسطة PAGE ، استخدم مشرطا معقما لقطع الجل بجوار حارة العلامة وصمة عار فقط جزء الجل الذي يحتوي على السلم مع عازلة تشغيل جديدة 1x TBE تحتوي على بقعة حمض نووي فائقة الحساسية. تصور سلم الحمض النووي واستخدم شفرة حلاقة لاستئصال شظايا الحمض النووي المهضومة من نوكلياز المكورات الدقيقة في نطاق الحجم بين 18 إلى 30 زوجا أساسيا تقريبا.

انقل شريحة الجل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تلطخ ما تبقى من الجل بصبغة الحمض النووي كما هو موضح سابقا. قم بتعريض الجل للأشعة فوق البنفسجية واحصل على صورة كسجل لخطوة استئصال الجل.

ابدأ هذا الإجراء باستخدام طرف ماصة معقم لسحق شريحة الهلام المستأصلة على جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف مجلدين من المحلول المؤقتة للذوبان PAGE واحتضانها عند 37 درجة مئوية على منصة دوارة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينة في جهاز طرد مركزي دقيق بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة.

انقل المواد الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مع الحرص على عدم نقل أي قطع هلامية مسحوقة. أضف 0.5 مجلدا من المخزن المؤقت للذوبان PAGE إلى حبيبات الهلام والدوامة وكرر الطرد المركزي. اجمع بين المواد الطافية واستخرج شظايا الحمض النووي باستخدام طريقة قياسية لاستخراج الفينول وكلوروفورم كما هو موضح في بروتوكول النص.

بالتوازي مع عزل شظايا الحمض النووي ، قم بتضخيم الروابط من متجه تعبير الحمض النووي الريبي الإرشادي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي. لضمان الاستنساخ الاتجاهي ، يتم بعد ذلك استيعاب الروابط باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتشغيل ملخص إنزيم التقييد للروابط على هلام الاغاروز بنسبة واحد بالمائة.

استئصال العصابات الصحيحة وتنقية الحمض النووي من قطع الهلام المستأصلة باستخدام مجموعة استخراج الجل. يتم استخدام مجموعة أدوات تخفيف الحمض النووي لتفاعل الإصلاح النهائي. أضف ما يلي في أنبوب ميكروفوج.

10 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى ، 1.5 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت ، 1.5 ميكرولتر من مزيج dNTP واحد ملليمولار ، 1.4 ميكرولتر من الماء و 0.6 ميكرولتر من إنزيم الضعف. احتضن عند 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم قم بتسخين وتنشيط الإنزيم عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 85 ميكرولترا من الماء وقم بتنظيف التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإعداد تفاعل ربط 14 ميكرولتر باستخدام كميات مولية متساوية من نوكلياز المكورات الدقيقة المهضومة والشظايا التي تم إصلاحها وتسلسلات الرابط كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ترجمة النك ، يتم تضخيم منتج الربط بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لفصل شظايا نوكلياز المكورات الدقيقة مع الرابط الخمسة الأولي والثالث المرفق بشكل صحيح من الأجزاء التي تحتوي على اثنين من الروابط الأولية الخمسة أو اثنين من الروابط الأولية الثلاثة ، اجمع بين جميع تفاعلات تفاعلات PCR ذات الدورة ال 15 ، وأضف صبغة تحميل الحمض النووي وقم بتشغيلها على هلام الاغاروز بنسبة 0.8٪.

استئصال الشريط البارز عند 869 زوجا أساسيا وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الهلام. حدد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، استنساخ الأجزاء المضخمة ل PCR في متجه تعبير الحمض النووي الريبي الإرشادي بواسطة تجميع جيبسون كما هو مفصل في بروتوكول النص.

لبدء هذا الإجراء ، يتم بناء إدراج ناقل النقية في أنابيب PCR المعقمة والمبردة مسبقا والحفاظ على الجليد. قم بتبريد كوفيت التثقيب الكهربائي بفجوة ملليمتر واحد على الثلج. أضف 25 ميكرولترا من خلايا TG1 المحضرة حديثا مباشرة إلى جزء واحد من الحمض النووي وانقل الخليط على الفور إلى كوفيت التثقيب الكهربائي.

بنقر الغبار أو النقر على الكوفيت للتأكد من توزيع الخلايا ومزيج الحمض النووي على طول حجرة الكوفيت دون أي هواء أو فقاعات محاصرة. ضع الكوفيت في حجرة الانزلاق وابدأ برنامج التثقيب الكهربائي المناسب. أضف على الفور 475 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 2TY إلى الكوفيت.

نقل البكتيريا الكهربائية إلى أنبوب 50 ملليلتر. كرر التثقيب الكهربائي الفردي ، واجمع كل الخلايا التي تم تحويلها بمكتبة واحدة في أنبوب واحد سعة 50 مليلتر وتوثيق الحجم الإجمالي. لتقدير العدد الإجمالي للمستعمرات للمكتبة بأكملها ، تم تحديد كمية صغيرة من البكتيريا التي تم تحويلها مع المكتبة على صفيحة أجار بحجم 10 سم مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.

لتقليل حجم ما تبقى من البكتيريا ، قم بعمل جهاز طرد مركزي بحوالي 4000 جم لمدة 10 دقائق أو حتى تتشكل لوحة مرئية ويبدو المادة الطافية واضحة. قم بإزالة كل ما عدا بضعة ملليلترات من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا. ضع البكتيريا في أطباق الاختبار الحيوي المطلية ب 2TY agar التي تحتوي على مجموعة المضادات الحيوية المناسبة.

انشر حجما مناسبا من تفاعل التثقيب الكهربائي للتحكم في pUC19 على طبق أجار إضافي بحجم 10 سم مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة. احتضن ألواح الأجار عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات على الألواح الخاضعة للرقابة لتقدير وحدة تكوين المستعمرة لكل ميكروغرام من الحمض النووي للبكتيريا بالإضافة إلى تعقيد المكتبة.

أخيرا ، اكشط البكتيريا من اللوحة لاستخراج الحمض النووي البلازميد. بعد تنقية الجل ، تم تحميل 1/6 من شظايا نوكلياز المكورات الدقيقة المنقاة على هلام PAGE بنسبة 20٪ لتأكيد اختيار الحجم والتنقية بنجاح. تم هضم أمبليكونات الرابط باستخدام إنزيمات التقييد لضمان ربط الروابط على شظايا نوكلياز المكورات الدقيقة المهضومة في الاتجاه الصحيح.

يظهر الجانب الأيسر من صورة الهلام التمثيلية هذه خمسة روابط أولية وثلاثة روابط أولية قبل وبعد الهضم باستخدام HindIII و SacII على التوالي ، مما يشير إلى الهضم الكامل للروابط إلى 637 زوجا أساسيا تنبؤيا و 295 زوجا أساسيا. يوثق الجانب الأيمن من صورة الهلام استئصال شظايا الرابط المهضومة. تم تحليل الربط الناجح للروابط بشظايا الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زيادة عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

عناصر التحكم المضمنة عبارة عن عنصر تحكم بدون قالب باستخدام عنصر التحكم في عدم وجود قالب من خطوة ترجمة النيك السابقة كمدخلات وعدم وجود تحكم في شظايا نوكلياز المكورات الدقيقة. فقط العينات التي تم فيها دمج شظايا نوكلياز المكورات الدقيقة مع الحمض النووي الرابط أنتجت السعة المتوقعة من 869 زوجا أساسيا. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على تعقيد المكتبة وإجراء تفاعلات تحكم أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبة RNA إرشادية للشاشات المستندة إلى CRISPR عن طريق تقطيع الحمض النووي إلى قطع صغيرة واستنساخها في العمود الفقري لناقل المكتبة.