تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنقية وعزل الخلايا البطانية الدماغية الأولية في الدماغ من أجل إنشاء نموذج ضيق في المختبر للحاجز الدموي الدماغي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحاجز الدموي الدماغي ، مثل توصيل الأدوية ، والنفاذية ، والاتجار بالمستقبلات ، بالإضافة إلى ضيق وقطبية BB. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هي العائد العالي للخلايا البطانية الدماغية الأولية التي يمكن استخدامها لإنشاء نموذج حاجز الدم الدماغي في المختبر الذي يتميز بارتفاع TEER ونفاذية منخفضة. لبدء هذا الإجراء ، ضع الأدمغة في مقعد تدفق معقم واغسلها برفق باستخدام لتر واحد من PBS في دورق يوضع على الثلج.

بعد ذلك ، قم بإزالة السحايا بعناية من كل دماغ باستخدام ملقط رفيع الأطراف. باستخدام مشرط ، اكشط المادة الرمادية من الأدمغة واحدة تلو الأخرى وانقل المادة المعزولة إلى أطباق بتري التي تحتوي على 20 مل من DMEM / F-12 الموضوعة على الجليد. للتجزئة الأولية ، قم بتشغيل مادة المادة الرمادية من خلال حقنة سعة 50 مليلتر بدون إبرة.

كرر الإجراء لجميع الأدمغة وقم بتجميع مادة المادة الرمادية المجمعة معا. انقل مادة المادة الرمادية المعزولة باستخدام وسيط DMEM / F-12 إلى أنبوب المطحنة لمحلل الأنسجة المحمول باليد. قم بتجانس المادة عن طريق عمل ثماني ضربات لأعلى ولأسفل باستخدام مدقة فضفاضة ، تليها ثماني ضربات لأعلى ولأسفل بمدقة ضيقة.

بعد ذلك ، قم بعزل الشعيرات الدموية عن طريق تصفية التجانس باستخدام زجاجة غطاء أزرق سعة 500 مل مع حامل مرشح وشبكة مرشح 140 ميكرون. ضع المرشحات المحتوية على الشعيرات الدموية في أطباق بتري بمحلول هضم. بعد ذلك ، احتضن أطباق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على شاكر مداري بسرعة 180 دورة في الدقيقة ، أو حركها برفق كل 10 دقائق.

بعد ساعة واحدة ، اغسل الشعيرات الدموية من المرشحات مع تعليق من طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتقسيم التعليق من الأطباق الثلاثة إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر وأوقف عملية الهضم عن طريق إضافة 10 مل من DMEM / F-12 إلى كل أنبوب سعة 50 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي معلق الخلية عند 250 مرة جم ، أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بشفط المواد الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 10 ملليلتر من DMEM / F-12. ثم أضف 20 مل أخرى من DMEM / F-12 إلى كل أنبوب. لتحسين ظروف ربط PBECs ، أضف محلول الطلاء إلى قارورة T-75 ، مما ينتج عنه تركيزات نهائية من الكولاجين الرابع عند 150 ميكروغرام لكل مليلتر والفيبرونيكتين عند 50 ميكروغرام لكل مليلتر وعن طريق الماء المقطر ، مع التأكد من أن المحلول يغطي السطح بالكامل.

بعد ذلك ، قم بإذابة الشعيرات الدموية في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. لإزالة وسط التجمد ، قم بتدوير الشعيرات الدموية لأسفل عند 250 مرة ، أربع درجات مئوية ، لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في واحد إلى ملليلتر من 10 ملليلتر.

بعد ذلك ، انقل التعليق الشعري إلى قارورة T-75 المطلية ، وقم بإمالة القارورة برفق لضمان التوزيع المتساوي على السطح. ضع قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإعداد 10 ملليلتر من وسط نمو PBEC ، مع استكمال البيورومايسين بمعدل أربعة ميكروغرام لكل مليلتر لقارورة T-75 واحدة وقم بإجراء تغيير متوسط.

بعد ذلك ، قم بإعداد إدخالات الغشاء القابلة للاختراق لبذر PBEC عن طريق طلاءها بالكولاجين الرابع عند 500 ميكروغرام لكل مليلتر ، والفيبرونيكتين عند 100 ميكروغرام لكل مليلتر ، والماء المقطر. قم بتحليل التربسين للخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من محلول التربسين-EDTA إلى قارورة T-75 ، وضعها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة خمس إلى سبع دقائق. لفصل الخلايا البطانية في الدماغ، اضغط برفق على جانب قارورة T-75 بأطراف الأصابع.

بعد ذلك ، قم بنقل محلول الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وقم بتدوير الخلايا البطانية في الدماغ عن طريق الطرد المركزي عند 250 مرة جم ، أربع درجات مئوية ، لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المتوسط. ثم أضف ملليلترين إضافيين من الوسط ليصل الحجم الإجمالي إلى ثلاثة ملليلترات.

احسب عدد الخلايا يدويا باستخدام غرفة عد الخلايا أو نظام عد الخلايا التلقائي. بالنسبة للزراعة المشتركة غير الملامسة ، قم بنقل الإدخالات إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا النجمية ، والتي تم تحديثها بوسط نمو الخلايا النجمية في اليوم السابق. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود على إدخالات الغشاء النفاذة التي تحتوي على PBECs.

بعد ذلك ، قم بشفط الوسط بعناية من الآبار وأضف 750 ميكرولترا من وسط التمايز إلى كل بئر. بعد ذلك ، قم بسحب الوسط بعناية من الإدخالات وإضافة 500 ميكرولتر من وسط التمايز لكل إدخال. ثم أضف 750 ميكرولترا المتبقية من وسط التمايز إلى كل بئر نجمي.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا بوسط التمايز عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، حتى اليوم التالي. في اليوم التالي لتحفيز الخلايا بوسط التمايز ، قم بإعداد نظام غرفة قياس مقاومة الأنسجة لقياسات TEER عن طريق شطف الغرفة مرتين بالماء المقطر ثنائي ، ومرة واحدة ب 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق ومرتين أخريين بالماء المقطر ثنائي المقطر. بعد ذلك ، قم بتوصيل الغرفة بالنظام ، وأضف أربعة ملليلتر من DMEM / F-12 إلى غرفة قياس مقاومة الأنسجة ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا.

بعد ذلك ، قم بإجراء قياسات TEER عن طريق وضع الإدخالات بعناية في غرفة قياس مقاومة الأنسجة. فيما يلي صور المجهرية لتباين الطور ل PBECs والثقافات والخلايا النجمية التي تم عرضها على مدار خمسة أيام. أظهرت شظايا الشعيرات الدموية المنقاة في اليوم الأول من الثقافة الأولية وجود كل من الشعيرات الدموية والخلايا الملوثة ، والتي بعد تغيير متوسط في اليوم الثاني ويوم إضافي من النمو ، أظهرت انتقاء ل PBECs ، وبدأت نموها من شظايا الشعيرات الدموية.

عادة ما يتم تحقيق طبقات أحادية التقاء من PBECs في اليوم الرابع إلى السادس ، وفي ذلك الوقت أظهرت PBECs مورفولوجيا على شكل مغزل وكانت محاذاة طوليا. تتكاثر الخلايا النجمية للفئران المزروعة في الآبار السفلية عادة إلى طبقات ملتقية في غضون خمسة أيام ، واستخدمت في نماذج الزراعة المشتركة غير الملامسة بعد أسبوعين من النمو. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في سبع ساعات.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف توصيل المخدرات والاتجار بالمستقبلات في الخلايا البطانية الضيقة والمستقطبة في الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج حاجز الدم الدماغي في المختبر يمكن استخدامه في الدراسات الجديدة التي لا يمكن إجراؤها في الجسم الحي.