تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

الترسب اميلويد هو السمة مميزة لأمراض مختلفة ويصيب الكثير من الأجهزة المختلفة. وتصف هذه الورقة تطبيق أوليجوثيوفيني مترافق الإنارة الفلورية تلطيخ في تركيبة مع تقنيات الفحص المجهري الأسفار. ويمثل هذا الأسلوب المصبوغة أداة قوية للكشف والتنقيب من المجاميع البروتين في الأجهزة السريرية والعلمية على حد سواء.

الهدف العام لهذه الطريقة هو الكشف عن رواسب البروتين المجمعة في كل من الإعدادات السريرية والعلمية. يتم وصف تلطيخ حمض الخليك هيبتا فورميل ثيوفين وتحليل الأنسجة من النماذج الحيوانية لمرض البريون ومرض الزهايمر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأميلويد ، مثل وجود كميات صغيرة من مجاميع البروتين واختلافاتها التوافقية الجوهرية.

ميزة هذه التقنية هي أنها أكثر انتقائية وحساسية من التقنيات التقليدية الأخرى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أمراض البروتين المختلفة بسبب إمكانية تخصيص المجسات لتقنية التصور المطلوبة. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن hFTAA يتطلب تركيزا منخفضا على التلوين.

يعرض HFTAA أيضا طولا موجيا أطول للإثارة والانبعاث مقارنة بالأصباغ التقليدية. تحضير محلول قليل اليغثيوفين المترافق المضيء عن طريق تعليق hFTAA المجفف بالتجميد في اثنين من هيدروكسيد الصوديوم ملليمولية لتحضير محلول مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر. انقل محلول المرق إلى قارورة زجاجية واحفظه على حرارة أربع درجات مئوية.

إذا تم استخدام أقسام مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين ، فقم بإزالة البارافينات في الزيلين طوال الليل. في يوم التلوين ، اغمر الأقسام في حمامات متتالية من 99٪ من الإيثانول ، و 70٪ الإيثانول ، و dH2O ، و PBS لمدة عشر دقائق في كل مرة. ثم اترك أقسام الأنسجة تجف في ظل الظروف المحيطة.

بينما يجف الأنسجة ، قم بإعداد محلول عملي ل hFTAA عن طريق تخفيف المخزون إلى 10 ، 000 في PBS. عندما يجف النسيج ، أضف قطرات من محلول عمل hFTAA إلى كل قسم من أقسام الأنسجة لتغطيته. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اشطف محلول التلوين ب 500 ميكرولتر من PBS ثم اغمر الشريحة في حمام PBS لمدة 10 دقائق. بعد السماح للقسم بالجفاف في ظل الظروف المحيطة ، قم بالتركيب باستخدام وسيط تركيب الفلورة. اسمح لوسط التركيب بالاستقرار طوال الليل.

يمكن إجراء الكشف عن الأميلويد مباشرة بعد التركيب ، أو حتى بدون تركيب. ومع ذلك ، إذا كان الهدف من التجربة هو جمع معلومات طيفية عالية الجودة ، يفضل الحضانة بين عشية وضحاها. افتح برنامج المجهر ، وقم بتسمية المشروع ، وحدد الصورة الطيفية ، وابدأ الاستحواذ.

حدد الكائن محل الاهتمام من خلال العين باستخدام مرشح الإثارة 436 نانومتر وقم بتحويل مسار الضوء إلى الكاميرا. في مدير بيانات الحالة، حدد نوع العينة الطيفي، وقم بتسمية العينة، واضغط على اكتساب. سيتم فتح نافذة الاستحواذ.

ضمن التصوير الطيفي ، افتح قائمة الإعدادات ، وحدد خصائص الاستحواذ ، واضبط النطاق الطيفي على 460 إلى 700 ، وجودة السرعة بأقصى سرعة ، ونوع القياس لمرشحات الليزر الضيقة للغاز أغلق مربع الحوار. في قائمة الصورة، حدد بث مباشر ممتلئ.

في شريط الرمز، قم بإيقاف تشغيل الهامش. حدد منطقة لتصويرها وتأكد من أن قيمة الذاكرة القصوى أقل من 800 ميغابايت. اضبط وقت التعريض الضوئي على قيمة تعطي سطوع الصورة الإجمالي بين 1,000 و 3,000.

في شريط الأيقونة، اضغط على الكاميرا الملونة. سيبدأ الاستحواذ. عند اكتمال الحصول على الصورة، اضغط على حفظ في مربع حوار الحصول على صورة طيفية وخلية جديدة في مربع حوار مدير بيانات الحالة.

من مدير بيانات الحالة، افتح الصورة التي تم جمعها باستخدام زر بدء التحليل. سيتم فتح نافذة تحليل البيانات. يمكن جمع المعلومات الطيفية من كل بكسل للصورة عن طريق تحديد عائد الاستثمار باستخدام مربع حوار العرض الطيفي.

اختر تحديد وتحديد عائد الاستثمار من المناطق ذات الصلة من الصورة. احفظ البيانات الطيفية كملف نصي باستخدام الزر Lib. يمكن استيراد ملف txt المحفوظ إلى أي برنامج تحليل من اختياره.

افتح برنامج المجهر وابدأ بإعداد المجهر متحد البؤر. اضبط شدة الليزر على 0.2٪ ، والثقب على وحدة Airy واحدة ، وحجم الإطار إلى 1 ، 024 × 1 ، 024 بكسل ، وسرعة المسح الضوئي على أنها سبعة بمتوسط أكثر من 16 عملية مسح ، وعمق البت على أنه ثمانية بت. لجمع طيف الانبعاث ، حدد وضع lambda وضبط ليزر الأرجون على 488 نانومتر.

اجمع الانبعاثات بين 499 و 691 نانومتر باستخدام 22 قناة في كاشف اللنفس 32 قناة. اضبط الكسب على 755. انقر فوق الزر Live وقم بتغيير اللوحة إلى مؤشر النطاق واضبط الكسب للسماح بوحدات البكسل غير المحملة بشكل زائد باللون الأحمر.

انقر فوق الزر "إيقاف" ثم التقط الصورة عن طريق زر المفاجئة. للحصول على صور أحادية القناة ، حدد خيار الإعداد الذكي. حدد FITC و Alexa 532.

حدد فك الخلط الخطي وقم بتطبيقه. اضبط الكسب للسماح بوحدات البكسل غير المحملة بشكل زائد. بالنسبة إلى FITC ، قم بتعيين الكسب على 693 ، وبالنسبة إلى Alexa 532 ، اضبط الكسب على 433 أثناء الوضع المباشر.

انقر فوق الزر "إيقاف" ثم التقط الصورة عن طريق زر المفاجئة. قم بتبديل المجهر إلى وضع FLIM. اضبط الثقب على 20 ، والطول الموجي للإثارة على 490 نانومتر ، وشدة الليزر على 0.5٪ استخدم الليزر النبضي عند 40 ميغا هرتز.

في برنامج FLIM ، قم بإعداد عد الفوتون الذي يزيد عن 550 نانومتر. في نافذة معلمات العرض ، اتبع عد الفوتون حتى يصل الحد الأقصى للعدد إلى حوالي 4 ، 000 عدد فوتونات. احفظ الملف وقم بتصديره كصورة SPC.

تظهر هذه الصورة أجسام مالوري دينك التي تتكون من مجاميع الكيراتين في خلايا الكبد الملطخة ب DAPI. هنا ، تظهر الشوائب الإيجابية P62 في الأنسجة العضلية الهيكلية لالتهاب عضلي الجسم المتقطع. تظهر هذه الصورة إدراج الأميلويد لعديد ببتيد الأميلويد في البنكرياس البشري.

هنا رواسب الأميلويد للسلسلة الضوئية للجلوبولين المناعي في الأمعاء البشرية. تظهر هذه الصورة رواسب من مجاميع بروتين البريون من سكرابي الأغنام في دماغ الفأر. تظهر هنا مجاميع بروتين البريون في دماغ الفأر المصاب بمرض الهزال المزمن.

تظهر هذه الصورة لويحات A-beta-amyloid في دماغ الفأر APP23. وتظهر هذه الصورة علم الأمراض A-beta في دماغ الفأر APP-PS1. تم تصنيف مسحات خزعة الدهون هذه من عينات تشخيصية من الأميلويد ترانسثيريتين في المرضى من البشر من واحد إلى أربعة وفقا لتصنيف الكونغو الأحمر القياسي.

تظهر المناطق الصفراء رواسب الأميلويد ترانسثيريتين الملطخة ب hFTAA ، والأزرق هو التألق الذاتي من الأنسجة الدهنية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تلطخ بتركيز منخفض بشكل كاف. تذكر أيضا استخدام مرشحات التمرير الطويل للحصول على أقصى قدر من التباين وتجنب التألق الذاتي وتلوين الخلفية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي من أجل تحديد البروتين المتراكم وتحديد البروتينات المجمعة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الداء النشواني لاستكشاف الهياكل المجمعة للبروتين والكيمياء العضوية لتصميم مجسات جديدة لهذه الأهداف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية القيام بتلوين LCO لتصوير كل منها بتقنيات مختلفة.