هندسة أنسجة القرنية: في المختبر نموذجا للتفاعلات Stromal العصب القرنية البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو التحقيق في التفاعلات الخلوية بين الخلايا اللحمية للقرنية البشرية والخلايا العصبية في مصفوفة خارج الخلية الطبيعية. يمكن توسيع البروتوكول لدراسة أمراض القرنية وضمور القرنية ، مثل القرنية المخروطية واعتلال القرنية السكري وضمور فوكس. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا القرنية البشرية ، من خلال تحديد الآليات والعيوب الأساسية في تفاعلات عصب السدى أثناء مرض أو ضمور القرنية المحدد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسمح للخلايا بإفراز مصفوفة خارج الخلية الخاصة بها في المختبر والتي توفر نموذجا أفضل وأكثر دقة لأنسجة القرنية البشرية الفعلية في الجسم الحي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض القرنية ، لأن تقييم تفاعلات الخلية والخلية خارج الخلية سيضمن تمثيلا دقيقا لأنسجة القرنية ، ويسمح بتطوير دواء أكثر استهدافا. الآن ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتلف العصب القرني وتجديده.

يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى ، مثل فحص الأدوية وتطويرها. عند استلام عينات من أنسجة القرنية البشرية ، انقل الأنسجة إلى طبق مساحته 21.5 سم مربع يحتوي على ملليلترين من محلول ملحي معقم من فوسفات دولبيكو. ضع قبة القرنية مقلوبة لأعلى واستخدم شفرة حلاقة بزاوية 45 درجة لكشط الطبقة الظهارية.

بعد ذلك ، اقلب قبة القرنية ووجهها لأسفل واكشط البطانة تماما من السدى. اغسل الأنسجة اللحمية باستخدام DPBS. حافظ على القطع اللحمية مبللة باستخدام DPBS ، واستخدم شفرة جراحية رقم 10 لتقطيع الأنسجة اللحمية إلى قطع صغيرة.

استخدم ملقطا معقما لنقل القطع اللحمية إلى قارورة ثقافة T25 بدون وسائط. اسمح للنباتات بالالتصاق بقاع القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 40 دقيقة. بعد قطع الأنسجة اللحمية بدقة ، انقل القارورة بعناية إلى الحاضنة.

من المهم السماح ب 30 إلى 40 دقيقة ، ثم إضافة الوسائط ببطء. هذه الخطوة ضرورية للسماح بالالتصاق الكامل للنباتات ، ومنع انفصالها. بمجرد الالتصاق ، أضف ببطء الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر ، الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات إلى القارورة ، دون إزعاج النباتات المسائية.

ضع القارورة برفق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اترك النباتات دون إزعاج حتى تبدأ الخلايا في العزل والهجرة في القارورة. بعد ما يقرب من أسبوعين إلى أربعة أسابيع ، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء 100٪.

عند التقاء 100٪ ، قم بتمرير الخلايا عن طريق إزالة وسط زراعة الأنسجة ، وغسل الخلايا باستخدام DPBS. أضف التربسين إلى الخلايا ، ثم احتضن عند 37 درجة مئوية. بعد حوالي خمس دقائق ، اعرض الخلايا تحت الفحص المجهري الضوئي للتأكد من انفصالها.

أوقف التحلل البروتيني عن طريق إضافة وسط جديد ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي الأنابيب عند 1000 × جم لتكوير الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات الخلايا في وسط جديد.

بعد إجراء تعداد الخلايا ، قم بالبذور حوالي 1 في 10 إلى الخلايا الست في قارورة ثقافة T75 مع وسط جديد لمزيد من التوسع. لتجميع بناء 3D ، قم أولا بالمرور وحساب الخلايا الليفية للقرنية البشرية ، ثم قم بزرع ما يقرب من مرة واحدة في 10 إلى ستة HCF على إدراج غشاء بولي كربونات مع مسام 0.4 ميكرون. أضف 1.5 مل من الوسط الطازج إلى الجزء العلوي من البناء.

ثم قم بتقطيع 1.5 مل أخرى من نفس الوسائط إلى أسفل كل بناء. بعد 24 ساعة ، أضف 1.5 مل من الوسط ، مع 0.5 ملليمولار فيتامين سي إلى أعلى وأسفل كل بناء. احتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أسابيع ، مع إضافة وسائط جديدة تحتوي على فيتامين سي كل يومين.

سيحفز هذا الخلايا على إفراز وتجميع مصفوفة خارج الخلية الخاصة بها. بعد ثلاثة أسابيع ، أضف ثمانية أضعاف 10 إلى خلايا الورم الأرومي العصبي البشرية SH-SY5Y الثالثة في الجزء العلوي من التركيبات ثلاثية الأبعاد التي تم تجميعها مسبقا. من الأهمية بمكان حساب عدد الخلية الدقيق في هذه الخطوة ، والسماح ب 24 ساعة قبل بدء تمايز الخلايا.

بعد 24 ساعة من الحضانة ، ابدأ تمايز خلايا SH-SY5Y عن طريق تحفيز الخلايا ب 1.5 مل من EMEM مع 10٪ FBS و 10 حمض الريتينويك الميكرومولاري. ثم أضف 1.5 مل من الوسط الذي يحتوي على فيتامين سي إلى قاع البنية. حمض الريتينويك حساس للضوء ، لذلك يجب تنفيذ هذه الخطوة في الظلام.

بعد خمسة أيام ، عندما تصل الخلايا إلى مرحلة التمايز ، أضف 1.5 مل من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على اثنين من BDNF نانو و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات إلى الجزء العلوي من البناء. أضف وسيطا طازجا مكملا بفيتامين سي إلى قاع البناء. استزراع الخلايا لمدة يومين إضافيين قبل المعالجة لمزيد من التحليل.

هذه صورة مجهرية إلكترونية عالية التكبير للبناء ذاتي التجميع ثلاثي الأبعاد تظهر غشاء البولي كربونات والخلايا اللحمية القرنية الموجودة في الأعلى. تظهر هذه الصورة الخلايا العصبية المتمايزة الموجودة في الأعلى ، والتي تظهر ترتيبا للخلايا العصبية اللحمية. تظهر الأسهم الموجودة في الصورة الخلايا العصبية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء أنسجة القرنية رطبة في جميع الأوقات ، عند قطع النباتات ، والحفاظ على الأدوات الجراحية والشفرات معقمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد واستخدام هذا النموذج في المختبر للتحقيق في تفاعلات الخلايا بين الخلايا اللحمية للقرنية البشرية والخلايا العصبية في مصفوفة خارج الخلية الطبيعية. لا تنس أن العمل مع BDNF وحمض الريتينويك والشفرات الجراحية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء ملابس واقية مناسبة ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.