رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

العام لهذه الطريقة عالية الإنتاجية باستخدام الينقولاز هو تحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها في الجينوم البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات اللاجينية مثل مواقع العناصر التنظيمية على مستوى الجينوم. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها قوية وقصيرة نسبيا وتتطلب مواد أولية أقل مقارنة بالطرق الأخرى لقياس إمكانية الوصول إلى الكروماتين مثل DNase-seq أو FAIRE-seq.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على المشهد التنظيمي للخلايا الليمفاوية التائية البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل الخلايا الأولية البشرية الأخرى والخلايا السرطانية والعينات السريرية البشرية وخلايا الثدييات والكائنات الحية الأخرى. قم بإذابة كمية ملليلتر واحدة من 10 ملايين PBMCs بشرية وانقله إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط RPMI التكميلي. هم ، يقومون بالطرد المركزي للخلايا عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 15 مل من وسط RPMI التكميلي. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى قارورة ثقافة T-75 واحتضانها طوال الليل مع الترطيب. في اليوم التالي ، انقل الخلايا العائمة بماصة معقمة سعة 25 مليلتر إلى أنبوب سعة 50 مل.

بعد ذلك ، عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد تريبان الأزرق. بعد ذلك ، اعزل الخلايا الإيجابية CD4 من 10 ملايين PBMCs حية غير ملتصقة باستخدام عمود فصل الميكروبيد. بمجرد عزل الخلايا ، قم بلوحة الخلايا التائية وتنشيطها في ظروف الاستقطاب Th1 و Th2 وفقا لبروتوكول النص ، ثم عزل نواتها.

للوجود ، قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل الطازج واحتفظ به مبردا على الجليد. أيضا ، استعدادا لتفاعل التبديل ، قم بتسخين شاكر حراري إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتحميل نصف مليون خلية تائية في أنابيب دقيقة سعة 1.5 مليلتر وقم بتدويرها عند 500 جي لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من PBS البارد وكرر دورة الدوران ، ولكن الآن قم بتعليق الخلايا في مليلتر واحد من محلول التحلل البارد. امزج الخلايا بسحب لطيف لمنع تعطيل النوى كثيرا. بعد ذلك ، خذ بسرعة 10 ميكرولتر لمراقبة جزء من تحلل الخلايا.

تأكد من الحفاظ على الخلايا باردة والعمل بسرعة. في غضون خمس دقائق ، تابع تفاعل التبديل. للبدء ، قم بنقل 100،000 نواة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مليلتر وقم بتدوير العينة عند 500 جي ثانية لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي بارد.

ثم قم بإزالة المادة الطافية برفق. بعد ذلك ، أضف مكونات تفاعل التبديل إلى النوى. بعد ذلك ، أعد تعليق النوى بسحب لطيف واحتضان النوى على شاكر الحرارة عند 500 RMP لمدة 30 دقيقة لإكمال تفاعل التحويل.

بعد ذلك ، قم بإجراء خطوة تنظيف الحمض النووي وقم بمسح شظايا الحمض النووي في 20 ميكرولترا من هيدروكلوريد تريس. بعد ذلك ، استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لإجراء تضخيم أولي لمكتبات تسلسل ATAC. بعد ذلك ، قم بتقييم العدد الأمثل للدورات الإضافية اللازمة للتضخيم النهائي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

من النتائج المقاسة ، حدد عدد الدورات اللازمة لتضخيم PCR النهائي لمكتبات تسلسل ATAC. ثم قم بإجراء التضخيم النهائي. يمكن أن يؤدي إعداد الحجم الأمثل لأجزاء مكتبة الحمض النووي إلى تحسين تسلسل الجيل التالي.

أولا ، قم بتسخين الخرزات المغناطيسية إلى درجة حرارة الغرفة وقم بإعداد 70٪ من الإيثانول الطازج في ماء خال من النوكلياز. بعد ذلك ، أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى مكتبات تسلسل ATAC بحجم 100 ميكرولتر. ثم أضف 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المرتبط بالحمض النووي المعلق.

قم بضرب الخرزات في الحمض النووي 10 مرات على الأقل وانتظر خمس دقائق. إذا علقت أي قطرات من الخرز على جدار الأنبوب أو الغطاء ، فقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة. الآن ، ضع العينة بجوار المغناطيس لمدة دقيقتين ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب دقيق جديد.

قم بقياس حجم المجموعة وأضف حجم 70٪ من تعليق الخرزة المغناطيسية. اخلطي الخرزات كما كان من قبل واتركيها تحتضن لمدة خمس دقائق قبل المتابعة. بعد ذلك ، افصل الخرزات باستخدام المغناطيس لمدة دقيقتين وتخلص الآن من المادة الطافية.

بينما لا تزال ضد المغناطيس ، أضف 200 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى الخرز. انتظر 30 ثانية ثم تخلص من الإيثانول وكرر غسل الإيثانول مرة أخرى. قم بإنهاء الغسالات عن طريق إزالة الإيثانول المتبقي تماما وترك الخرزات تجف في الهواء لمدة خمس دقائق على المغناطيس.

إذا لزم الأمر، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة واستنشق أي إيثانول مرئي باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر. الآن ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأضف 22 ميكرولتر من هيدروكلوريد Tris. بعد دقيقتين ، أعد الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي واترك المحلول واضحا.

بعد ذلك ، اجمع 20 ميكرولترا من التحطي الذي يحتوي على المكتبة المعدة وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. ينتج هذا البروتوكول مكتبات تسلسل ATAC التي عادة ما تكون من ثلاثة إلى 20 نانوغرام لكل ميكرولتر. عند تشغيلها على نظام لتحليل سلامة الحمض النووي ، يكون لها مظهر يشبه السلم.

من بين أمور أخرى ، من بين أمور أخرى مهمة مراقبة الجودة إثراء الضوابط الإيجابية. بالنسبة لعناصر التحكم السلبية ، يجب إثراء زوج التمهيدي الثالث 25 ضعفا على الأقل ، ويجب إثراء زوج التمهيدي الرابع بمقدار 75 ضعفا على الأقل. بعد 10 ملايين قراءة أولية ، إذا اجتازت العينة جميع المعلمات الحاسمة في ملف تقرير FastQC ، وتم الحصول على 1 ، 000 إلى 2 ، 000 ذروة من ذروة الاتصال ، فيمكن تسلسل المكتبة بشكل أعمق لأكثر من 30 مليون قراءة.

من المكتبات التي تلبي معايير الجودة ، يتم تعيين ستة إلى 20٪ فقط من القراءات إلى جينوم الميتوكوندريا. خريطة القراءة الفريدة المتبقية إلى الجينوم البشري المرجعي وسبعة إلى 12٪ تقع ضمن قمم تسلسل ATAC. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبات ATAC-seq ، وتقديم وتقديم تسلسل الحصص الغذائية وتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.

بمجرد إتقانها ، يمكن إعداد مكتبة ATAC-seq في يوم أو يومي عمل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنك ربما تحتاج أولا إلى تحسين بعض الخطوات مثل عدد الخلايا وتكوين المخزن المؤقت للتحلل في خطوة عزل النوى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الترسيب المناعي للكروماتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل عامل النسخ الذي يرتبط بمناطق الكروماتين المفتوحة في العينات التي تم فحصها؟