ميكرورنا استناداً إلى خزعة سائلة: تجربة ميرنا البلازما التوقيع المصنف (MSC) "فحص سرطان الرئة"

هنا، نقدم البروتوكول التفصيلية المعتمدة في بيوميلد فحص المحاكمة إجراء اختبار المصنف التوقيع microRNA المتداولة للكشف المبكر عن سرطان في الرئة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مستويات 24 microRNAs منتشرة في البلازما من أجل تحديد خطر الإصابة بسرطان الرئة لدى المدخنين الشرهين الذين تزيد أعمارهم عن 50 عاما. يمكن أن تزيد هذه الطرق من فعالية تكلفة برامج فحص التصوير المقطعي المحوسب بجرعة منخفضة للكشف المبكر عن سرطان الرئة عن طريق تقليل عدد العقد الإيجابية الكاذبة وربما الإفراط في التشخيص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من السهل قياس إفراز الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام المعدات القياسية التي تعتمد المختبرات الجزيئية الشائعة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في دراسة دور البيئة المكروية للورم في تطور سرطان الرئة. تعكس MicroRNAs استجابة المضيف والتفاعل الديناميكي بين الورم وبيئته الدقيقة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لفهم إجراءات التشغيل القياسية التي يجب اتباعها لهذا النوع من التحليل الجزيئي بشكل أفضل.

لبدء هذا البروتوكول ، استخدم أنابيب الفراغ لجمع 10 ملليلتر من عينة الدم الكاملة. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. لا تخزن الدم الكامل في درجة حرارة منخفضة ، مثل أربع درجات مئوية ، لتجنب الصدمة الحرارية وتحلل الخلايا.

يقودنا ذلك إلى إصدار محدد من microRNA. الطرد المركزي البلازما في غضون ساعة واحدة لفصلها. مع التأكد من تجنب ملامسة الحلقة اللمفاوية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 15 مل. ثم ، قم بالطرد المركزي للطافية في نفس الظروف. قم بنقل مليلتر واحد من مادة طافية البلازما هذه إلى قوارير تبريد سعة 1.5 مليلتر ، مع الحرص على تجنب جمع جزء البلازما من قاع الأنبوب.

لبدء عزل الحمض النووي الريبي ، أضف 200 ميكرولتر من محلول OMG المبرد مسبقا إلى 200 ميكرولتر من البلازما لكل عينة. لضمان دوامة التجانس الكاملة لمدة 15 إلى 30 ثانية. لتجانس العينة ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل و 25 ميكرولترا من البروتين ASK لكل عينة ، والدوامة لمدة 20 ثانية.

ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية في الخلاط الحراري لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، حدد طريقة RSC mi-RNA Tissue وقم بتحميل خرطوشة لكل عينة على صينية سطح السفينة لمستخرج أوتوماتيكي للأحماض النووية ، مع وضع المكبس بشكل صحيح. انقل المحللة وأضف خمسة ميكرولترات من محلول DNase إلى مواقعها المناسبة في خرطوشة الجهاز.

أضف إلى قاعدة كل أنبوب شطف 60 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. لبدء التنقية التلقائية ، ابدأ التشغيل قم بتخزين إجمالي عينات الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية.

لتحويل الحمض النووي الريبي إلى CDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي Taq miroRNA ، استخدم أداة Taq RT التمهيدي مع mi-RNAs ذات الأهمية. في أنبوب سعة 1.5 مل يوضع على الثلج ، قم بإعداد مزيج تفاعل RT وفقا لتعليمات المجموعة. ثم أضف 3 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة ، إلى الحجم النهائي البالغ 15 ميكرولترا.

احتضن على الثلج لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتحميل العينات على جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل تفاعل RT. ثم امزج 2.5 ميكرولتر من كل منتج تفاعل RT مع Taq Master Mix 2X و Custom Taq pool.

أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولترا. قم بإجراء تفاعل التضخيم المسبق في جهاز تدوير حراري باستخدام ملف تعريف حراري محدد. ثم قم بتخفيف كل منتج بإضافة 175 ميكرولتر من 0.1 XTE PH 8.0.

أولا ، امزج 1.13 ميكرولتر من العينة المخففة مسبقا مع 2X Taq Universal Master Mix في أنبوب 0.5 مل. ثم أضف الماء الخالي من النوكلياز. لقياس مستويات البلازما ل 24 miRNAs محددة على ثماني عينات في وقت واحد ، استخدم بطاقة microRNA مخصصة لمجموعة Taq ذات 384 بئرا.

قم بتحميل ما يصل إلى ثمانية تفاعلات باستخدام مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على البطاقة. قم بالطرد المركزي للبطاقة المخصصة عند 311 مرة G ، لمدة دقيقتين وختمها باستخدام سدادة بطاقة المصفوفة. أخيرا ، ضع البطاقة في نظام PCR في الوقت الفعلي وقم بتشغيل تفاعل PCR في الوقت الفعلي.

لاستقراء البيانات وتحليلها ، استخدم البرامج المناسبة واحصل على قيم CT الأولية. قم بتعيين خط أساس تلقائي لإزالة إشارات الخلفية وعتبة ثابتة تبلغ 0.15 لجميع المقايسات والعينات. يجب إجراء خطوة مراقبة الجودة قبل التحليل لتحديد عينات البلازما المحللة غير القابلة للتحليل والتي يمكن أن تحدث فيها نتائج خاطئة من الإطلاق غير المحدد للميرنا المرسال بواسطة خلايا الدم.

يظهر التحليل الطيفي لعينات البلازما الذي يقيس نسبة الامتصاص بين الأطوال الموجية A414 و A375 الفرق بين العينات غير القابلة للتحليل المحللة والعينات غير المحللة. لتحديد أي مشكلات فنية، يتم تقييم أداء RT-QPCR. تؤدي أربع بطاقات موائع دقيقة عالية الجودة إلى RT-QPCR بأداء منخفض ، وفي هذه الحالة يجب إعادة تحميل منتج التضخيم المسبق إلى بطاقة موائع دقيقة جديدة.

تؤدي بطاقات الموائع الدقيقة عالية الجودة إلى أداء جيد ، ثم تخضع هذه البطاقات لخطوتين لمراقبة الجودة التحليلية. بعد تنفيذ خطوات مراقبة الجودة ، يتم تطبيق مصنف توقيع الحمض النووي الريبي الصغير. يتم إنشاء التوقيعات الأربعة لنسب miRNA التي تتكون منها MSC.

خطر الإصابة بالمرض ، وخطر الإصابة بمرض عدواني ، ووجود مرض ، ووجود مرض عدواني. من خلال الجمع بين التوقيعات الأربعة ، يتم تعريف مستوى المخاطرة أخيرا على أنه منخفض أو متوسط أو مرتفع. بمجرد إتقان ، باستثناء أسبوع واحد من تخزين البلازما عند 80 درجة مئوية ، يمكن إجراء هذه التقنية في عشر ساعات.

تحليل ثماني عينات في وقت واحد. تم اختبار مصنف توقيع الحمض النووي الريبي الصغير حتى الآن على أكثر من 10000 عينة تم جمعها من أكثر من 4000 متطوع مسجلين في تجربة فحص BioMed Lancaster. من المحتمل أن تتيح هذه الاختبارات اتساقا أكبر لخوارزمية التشخيص.

كما أنها تقلل من تكاليف الفحص. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد ، والسماح بقياس مستويات miRNA المنتشرة من أجل استخدامها كمؤشر حيوي لتشخيص السرطان والأمراض الشديدة الأخرى.