جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

الهدف العام من تصنيع جهاز التصوير هذا هو إنشاء منصة قابلة للتعديل للتحليل المجهري لالتئام الجروح في يرقات الزرد الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التئام الجروح مثل مساهمة إعادة تنظيم ألياف الكولاجين والاستجابات الخلوية لإعادة نمو الأنسجة اللاحقة بعد الإصابة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الجرح والتصوير يحدثان داخل جهاز واحد ، بينما لا يعيق الجهاز إعادة نمو الذيل.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل المقصورات الوظيفية المتعددة ل zWEDGI بشكل مستقل لاستيعاب مراحل اليرقات المختلفة ومجموعة من البروتوكولات التجريبية. للبدء ، قم بنمذجة مكون PDMS للجهاز بالأشكال الهندسية والسمات المطلوبة وفقا لبروتوكول النص. بعد طباعة القوالب باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد من البوليمر الضوئي ، قم بتنظيف القوالب باستخدام فرشاة دقيقة ، والكحول المشوه في زجاجة رذاذ ، والهواء المضغوط.

افرك الراتنج غير المعالج برفق وقم بإزالته ، وخاصة أي مادة من مناطق القنوات الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإصلاح القوالب في جهاز ما بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة على كل جانب ، حيث أن الراتنج غير المعالج سام ليرقات الزرد. باستخدام ورق صنفرة 200 حبيبة رملية ، قم برمل جانب تجويف القالب على سطح مستو حتى تتلامس جميع أسطح السقف مع ورق الصنفرة.

مع ورق صنفرة 400 و 600 حبيبة رملية ، قم برمل برفق تدريجيا لإنتاج أسطح ناعمة ومتدفقة عبر جميع الواجهات الهندسية للقالب. بعد ذلك ، استخدم مؤشر الاتصال لقياس عمق التجويف بعد الصنفرة للتحقق من أنه قريب من عمق التصميم. قم بتنظيف القوالب وأقراص الغطاء الزجاجي عن طريق وضعها في منظف بالموجات فوق الصوتية مملوء بالماء لمدة 30 دقيقة أو عن طريق غسلها تحت الماء الجاري.

استخدم كحول الأيزوبروبيل والهواء المضغوط المصفى لتنظيف القوالب والأغطية وتجفيفها. قم بإعداد مقعد نظيف كمكان لتصنيع الأجهزة لتقليل التلوث من الحطام المحمول جوا. اصنع PDMS عن طريق صب القاعدة والمنشط بنسبة 5: 1 في كوب بلاستيكي.

باستخدام عصا خشبية ، اخلطي جيدا لمدة دقيقتين ، مع تحريك الجل على نفسه مثل عجن الخبز. قم بإزالة الخليط في مجفف مفرغ من الهواء لمدة 25 إلى 45 دقيقة حتى تختفي جميع الفقاعات. بعد ذلك ، باستخدام حقنة 10 مليلتر ، املأ تجويف كل قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد بحوالي 0.75 مل من PDMS حتى يفيض القالب قليلا مع الغضروف المفصلي.

قم بإزالة القوالب المملوءة لمدة 45 دقيقة لإزالة الفقاعات الإضافية التي ربما تكون قد تشكلت عند التعبئة. ضع قرصا بغطاء زجاجي أعلى القالب المملوء بنظام إدارة البرمجيات الحيوية، واضغط على القرص لأسفل بزاوية لمنع الوقوع في الفقاعات. اسمح بطرد PDMS الزائد عند تطبيق غطاء القرص الزجاجي.

بعد ذلك ، استخدم مشبك سقاطة صغير لتثبيت قرص الغطاء بإحكام على القالب. من أجل الكفاءة ، يمكن استخدام جهاز متعدد المشابك. عالج جهاز PDMS والقوالب المثبتة عند 100 درجة مئوية في فرن لمدة 90 دقيقة على الأقل.

ثم أخرج القوالب من الفرن واتركها تبرد حتى يمكن التعامل معها بسهولة. قم بتثبيت القالب الذي يحتوي على جهاز PDMS المعالج في نائب المقعد بحيث تكون أشكال هندسة القالب متجهة لأعلى ، بالتوازي مع مقعد محطة العمل. ابدأ في إزالة جهاز PDMS باستخدام ملاقط مسطحة لتحرير صنبور سحب PDMS من القالب.

ثم اعمل حول محيط القالب باستخدام الملقط. يجب معالجة PDMS لمدة 90 دقيقة على الأقل عند 100 درجة مئوية وإلا ستظل لزجة وتلتصق بالقالب. من المؤشرات الجيدة على أنك عالجت الجهاز لفترة كافية هو أنك سترى بالفعل فقاعة هواء في الواجهة بين القالب وجهاز PDMS ، مما يشير إلى أنه سيتم إزالته بسهولة.

استخدم الهواء المضغوط والملقط المصفى لرفع الجهاز برفق من القالب عن طريق التمسك بعلامة تبويب السحب ونفخ الهواء أسفل الجهاز. بعد ذلك ، ضع جهاز PDMS رأسا على عقب على الجزء الداخلي من غطاء الطبق السفلي الزجاجي بحيث تلامس أسافين النفق التقييدي البلاستيك. بعد ذلك ، ضع غطاء الطبق مع zWEDGI المقلوب والطبق السفلي الزجاجي المقابل في منظف البلازما بحيث يكون الزجاج الداخلي متجها لأعلى.

قم بإخلاء غرفة تنظيف البلازما حتى يصل الضغط إلى 500 ملليتور. اضبط تردد الراديو، أو طاقة التردد اللاسلكي، على مستوى عال وعرض الجهاز والطبق لتردد التردد اللاسلكي لمدة دقيقتين تقريبا. بعد ذلك ، قم بإزالة ضغط الغرفة ببطء وأعد الجهاز والطبق إلى غطاء غرفة نظيف.

قم بإزالة جهاز PDMS من غطاء الطبق. بعد ذلك ، اقلب PDMS zWEDGI إلى الاتجاه الصحيح على الزجاج عن طريق وضعه بعناية على البئر الأوسط للطبق السفلي الزجاجي. لضمان التصاق PDMS بالزجاج ، استخدم الطرف الخلفي للملاقط لممارسة الضغط حول الأشكال الهندسية الدقيقة للقنوات الدقيقة ، مما يؤدي إلى تنعيم PDMS نحو الحواف.

اضغط برفق على جهاز PDMS لضمان عدم احتجاز فقاعات الهواء أسفل الجهاز. أضف 70٪ من الإيثانول إلى الطبق وباستخدام ماصة دقيقة ، اشطف القنوات بما في ذلك من خلال نفق التقييد. بعد ذلك ، قم بإزالة الإيثانول واستخدم الماء المقطر المزدوج لشطف الجهاز مرتين أو ثلاث مرات قبل السماح له بالجفاف في الهواء.

املأ القنوات بالحليب الخالي من الدسم ، واحتضن الجهاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتقليل التصاق اليرقات بزلة الغطاء الزجاجي للطبق. بعد ذلك ، اغمر الجهاز برفق عدة مرات في ماء مقطر مزدوج لشطفه ، واتركه يجف في الهواء رأسا على عقب. بعد تخدير اليرقات وفقا لبروتوكول النص ، استخدم بضعة ميكرولترات من tricaine E3 لتبليل قنوات الجهاز مسبقا.

باستخدام طرف ماصة الفتحة العريضة، التقط يرقة واحدة وقم بإيداعها في قناة التحميل. بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة أو أداة مماثلة ، قم بتوجيه اليرقة في غرفة التحميل بحيث يكون الجانب الظهري مواجها للحافة الأكثر استقامة لغرفة التحميل ، والذيل المواجه لنفق التقييد. اسحب السائل بعناية من غرفة الجرح ، مما يسمح لليرقة بالتدفق إلى نفق التقييد.

قم بإزالة معظم السائل مع الحفاظ على الرطوبة حول اليرقة. يجب توجيه اليرقة بشكل صحيح في النفق التقييدي حيث تتم إزالة معظم السائل. ولكن يجب أن يبقى سائل كاف حول اليرقات.

يمكن تعديل الاتجاه بعد إضافة الاغاروز ولكن يجب تحقيقه قبل أن يتجمد الاغاروز. ماصة 1٪ LMP agarose في tricaine E3 فوق رأس اليرقة ، وتملأ غرفة التحميل ، وتسمح للأغروز بالتصلب مع اليرقة في الموضع الصحيح. أضف tricaine E3 إلى حجرة الجرح حسب الحاجة للحفاظ على الترطيب.

ثم كرر عملية التحميل هذه للقناتين المتبقيتين. باستخدام إبرة حقنة ، قم بإزالة أي agarose بعناية يتسرب عبر نفق التقييد إلى غرفة الجرح. للجرح أو التصوير قصير المدى أو عزل علاج الجروح ، أضف المزيد من التريكائين E3 فوق الاغاروز.

لجرح اليرقات في حجرة الجرح ، استخدم شفرة مشرط معقمة لتمرير زعنفة الذيل الخلفية إلى الحبل الظهري. أضف تريسين E3 إضافيا إذا لزم الأمر واستبدل غطاء طبق الزيادة. قم بتثبيت جهاز zWEDGI مع يرقات مخدرة على مجهر مقلوب في ملحق مرحلي يستوعب الطبق السفلي الزجاجي 60 ملم.

حدد موقع ذيل اليرقات في القناة العلوية ، وقم بتدوير الطبق حسب الحاجة للحصول على الذيل في الموضع المطلوب. صور اليرقة كما هو مطلوب للتجربة المحددة. في ختام التجربة ، قم بإزالة طبق zWEDGI من المجهر.

بعد إزالة اليرقات والأجار وفقا لبروتوكول النص ، استخدم الإيثانول والماء المقطر لتنظيف zWEDGI كما هو موضح سابقا ، ووضعه رأسا على عقب حتى يجف في الهواء. قم بتخزين الجهاز المغطى في مكان بارد وجاف. تظهر هنا صور باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون للتصوير التوافقي الثاني ، أو تصوير SHG لألياف الكولاجين في الزعنفة الذيلية لتوضيح قدرات التصوير ل zWEDGI.

قبل الجرح ، اكتشف SHG ألياف الكولاجين التي تشع إلى الخارج من الحبل الظهري إلى طرف الزعنفة. بعد فترة وجيزة من الجرح ، تزداد المسافة بين طرف الزعنفة المتقلصة ومركز الزعنفة مع استرخاء الجرح. يسمح zWEDGI بجمع البيانات ثلاثية الأبعاد بمرور الوقت ، مما يوفر رؤية أكثر اكتمالا للتغيرات الديناميكية التي تحدث في بنية المصفوفة خارج الخلية.

تسمح الطبيعة ثلاثية الأبعاد لجمع البيانات بإعادة البناء المكاني باستخدام برنامج التقديم. توضح عمليات إعادة البناء هذه وخيارات الدوران اللاحقة أن تقلص الزعنفة واسترخائها يحدث ليس فقط في المستوى XY لمجموعة الصور ، ولكن أيضا في المحور Z ، حيث يتسطح الذيل من الضفيرة الصاعدة للحالة المتعاقدة. بمجرد طباعة القوالب القابلة لإعادة الاستخدام ، يمكن إجراء تقنية التصنيع في غضون ثلاث إلى أربع ساعات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة في PDMS قبل المعالجة ومعالجة الأجهزة لفترة كافية قبل محاولة إزالتها من القوالب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تطبيق الأدوية الموضعية ، أو وضع العلامات على الأجسام المضادة ، أو تنقية الحمض النووي الريبي والبروتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تأثير وجود الأدوية أو المثبطات على التئام الجروح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التئام الجروح لاستكشاف ديناميكيات الكولاجين واستجابة الخلايا المناعية وإعادة نمو الأنسجة في يرقات الزرد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع zWEDGI واستخدامه للجرح والتصوير المباشر ليرقات الزرد. لا تنس أن راتنجات الطباعة ثلاثية الأبعاد من البوليمر الضوئي تشكل خطورة على البشر وسامة لأسماك الزرد. يجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات واستخدام قناع الوجه أثناء التعامل مع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد غير المعالجة ، والتأكد من معالجة جميع الراتنج المتبقي على المطبوعات قبل محاولة ملء القوالب ب PDMS.