يناير 20, 2018
أسلوب للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على أساس ديندريمير التي تسمح بمراقبة النانو المحلية ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك حمض (إدارات) السطحية الكثافة الموصوفة وتطبيقها لدراسة الخلية التمايز الالتصاق وتشوندروجينيك.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو الحصول على أنماط نانوية غير متساوية قائمة على التغصنات على نطاق واسع تسمح بالتحكم النانوي في التصاق السطح المحلي. يتم تطبيق الطريقة الموصوفة لدراسة التصاق الخلايا والتمايز الغضروف. تسمح الأنماط النانوية المرتفعة بالتغصنات بالتحكم محليا في التصاق السطح على المستوى النانوي.
يتم استخدام الجيل الأول من البولينانومرات المعدلة باستخدام ببتيد RGD اللاصق للخلية لإنشاء أنماط نانوية. تتميز بتقنيات المسح الضوئي لكل مجهر وتستخدم في دراسات التصاق الخلايا وتمايزها. ثم نقوم بتحليل نتائج الفحص المجهري وتقنيات التلوين المناعي.
الخطوة الأولى هي تحضير ركائز العمل. يتم إنتاج شرائح زجاجية مربعة مخصصة عن طريق قطع شرائح الفحص المجهري باستخدام قاطع مائلة بالماس. اصنع شرائح بحجم 1.25 × 1.25 سم.
اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات ، متبوعا بنسبة 96٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء. تحضير محلول 2٪ PLLA عن طريق إضافة 200 ملليغرام من PLLA إلى أنبوب الضغط وإضافة 10 مل من الديوكسان. أضف شريط التحريك وأغلق الأنبوب بإحكام.
سخني الخليط في حمام الجلسرين على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تحت التحريك اللطيف. ضع الشرائح الزجاجية في قارورة زجاجية تحتوي على محلول PLLA على لوح نظيف وساخن عند 60 درجة مئوية. انتظر 10 دقائق على الأقل للوصول إلى درجة الحرارة اللازمة.
قمبتدوير الركائز الزجاجية بمحلول PLLA عن طريق وضع الشريحة الزجاجية على مرحلة طلاء الدوران وتشغيل البرنامج المحدد. نختار 3 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 1 ، 500 دورة في الدقيقة في الثانية مع خطوة مسبقة تبلغ 500 دورة في الدقيقة عند خمس ثوان بسرعة 300 دورة في الثانية لضمان طلاء متجانس. يمكن تخزين الأكواب المطلية بالدوران في الثلاجة.
تحضير وصوتنة لمدة 10 دقائق محلول أ ، محلول 0.77 ملليغرام لكل مليلتر من RGD-Cys-D1 dendrimer في الماء منزوع الأيونات. ثم قم بإعداد محاليل التغصنات من 10 إلى 2٪ و 10 إلى 5٪ محلول B و C على التوالي في الماء منزوع الأيونات. محلول Sonicate C لمدة 10 دقائق وقم بإعداد محاليل التغصنات التالية ، D و E و F أيضا في الماء منزوع الأيونات.
الحل D ، 2.5 × 10 إلى 8٪ الحل E ، 10 إلى 8٪ والمحلول F ، 4 10 إلى 9٪ احتفظ بهذه الحلول في الثلاجة حتى الاستخدام. تتخرج بمصباح للأشعة فوق البنفسجية لكابينة ثقافة الخلية 18 زجاجا مطلي ب PLLA لمدة 13 دقيقة لجعلها معقمة. قم بتقطيع كل من محاليل التغصنات لمدة 10 دقائق.
قم بتصفية محاليل التغصنات من خلال مرشحات قطرها 0.22 ميكرومتر على الشرائح الزجاجية المطلية ب PLLA في صفيحة 12 بئر تحت التدفق الصفحي لكابينة زراعة الخلايا. اتركها داخل المقصورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة واغسلها بالماء المعقم منزوع الأيونات. بالنسبة لعينات التحكم الإيجابية ، قم بإعداد محلول فيبرونيكتين معقم في PBS واحتضان النسخ المتماثلة بالمحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في كابينة زراعة الخلايا.
اغسلهم باستخدام PBS. ستكون الركائز الثلاثة المتبقية المطلية ب PLLA بمثابة نسخ متماثلة للتحكم السلبي. يتم تحليل تضاريس النمط النانوي باستخدام AFM الذي يتم تشغيله في وضع التنصت في الهواء.
قم بتركيب ناتئ من السيليكون بثابت زنبركي يبلغ 40 نيوتن لكل متر وتردد رنين يبلغ 300 كيلو هرتز في حامل طرف AFM. مع ركيزة النمط النانوي في مرحلة AFM ، اقترب من السطح حتى التلامس واختر نقطة ضبط السعة التي تسمح بتصوير تكوين التغصنات دون ممارسة ضغط مفرط على السطح. سجل ما لا يقل عن ثلاث صور تمثيلية بحجم 5 × 5 ميكرومتر لكل ركيزة من ثلاث ركائز مستقلة لكل شرط.
تعامل مع الصور المكتسبة باستخدام برنامج معالجة AFM. حدد التشعبات على صور ارتفاع AFM المعالجة واحصل على عتبات الصورة المقابلة. احصل على دقة الجسيمات واستخدمها للحصول على الحد الأدنى من المسافات بين الجسيمات.
دع الحد الأدنى للمسافات بين الجسيمات في Z إلى دقة الجسيمات المقابلة للحصول على سدادات التحكم في الاحتمالات للمسافات الدنيا بين الجسيمات. اضبط مقياس ألوان المؤامرة لتصور المناطق التي تكون فيها كثافة سطح RGD المحلية أقل من 70 نانومتر. حدد مساحة هذه المناطق عن طريق تحديدها على الصورة وإنشاء عتبة.
استخدم الدهون البشرية التجارية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة من الممرات المبكرة ، ويفضل أن تكون أقل من خمسة. زراعتها عند 37 درجة و 4.6٪ ثاني أكسيد الكربون2 في وسط نمو الخلايا الجذعية حتى الوصول إلى التقاء 70 أو 80٪. زرع الخلايا بكثافة خلية تبلغ 3 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على الركائز في وسط تحفيز الغضروف.
قم بتغيير الوسيط كل ثلاثة أيام. يمكن ملاحظة خطوة التكثيف من اليوم الأول في الثقافة ، ويمكن أن يتبع تطورها مجهر تباين الطور البصري خلال جميع مختبرات الاستزراع. ثبت الخلايا بمحلول فورمالين 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم اغسلها باستخدام PBS.
قفل مجموعات الفورالديهايد عن طريق إضافة محلول 50 مللي مولار من كلوريد الأمونيوم في PBS. اتركيه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع PBS.
تخلل الخلايا بمحلول 0.1٪ من الصابونين في محلول حجب 1٪ من الألبومين في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع PBS.
احتضان الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وتجنب التعرض للضوء. يغسل مع PBS ويجفف. ضع وسيط تركيب الفحص المجهري على العينات وقم بتغطيتها برفق بزلات الغطاء.
قم بتصوير العينات الملطخة بالمناعة لبروتين الالتصاق البؤري باكسيلين بعد يوم واحد من الحث الغضروفي ، وللعلامة الغضروفية المبكرة ، الكولاجين الثاني ألفا الأول بعد خمسة أيام من الحث الغضروفي باستخدام مجهر متحد البؤر المستقيم. اجمع الأقسام على فاصل زمني تمثيلي ، على سبيل المثال 0.5 أو 1 ميكرومتر. قم بتصفية الصور الملطخة بالباكسيلين من المنطقة القاعدية لمكثفات الخلية.
قم بإزالة الخلفية ، وقم بتنعيم ، وقم بتحويلها إلى ملفات ثمانية بت. اجعلها ثنائية عن طريق تعيين عتبة محددة تجريبيا. عالج ما لا يقل عن ثلاثة مكثفات خلوية لكل حالة من ثلاث عينات مستقلة.
حدد المناطق المحددة وعبر عنها كنسبة مئوية مقابلة من المساحة مقسومة على عدد نوى الخلية في الصورة. لتحديد صبغة الكولاجين II ألفا I ، قم بإنشاء نتوءات Z متحدة البؤر. قم بتصفية الصور الناتجة وإزالة الخلفية وتنعيمها وتعيين عتبة.
حدد مجموع المساحة المتوقعة الحد الأقصى لمساحة الكولاجين II ألفا I لكل عينة مقابل مساحة مكثف الخلية المقابلة. يمكن الحصول على تكوينات نانوية مختلفة لتعديل تركيز التغصنات الأولي في المحلول. يمكن تصور الأنماط النانوية عن طريق تحليل AFM ومخططات كفاف الاحتمالات للحد الأدنى من المسافة بين الجسيمات التي تم إنشاؤها.
إنها تسلط الضوء على المناطق الموجودة على السطح ذات أعلى كثافة سطح RGD محلية. تستخدم الأنماط النانوية للتغصنات في دراسات التصاق الخلايا. يزداد الالتصاق مع كثافة سطح RGD المحلية.
بالنسبة للتحكم الإيجابي والأسطح التي تحتوي على مجاميع التغصنات ، يتم فقد هذا الارتباط. تم اختبار تأثير كثافة سطح RGD المحلية في تكوين الغضروف ، ويفضل كل من تكثيف الخلايا وتمايزها من خلال الأنماط النانوية التي تقدم التصاق وسيط. في الختام ، النمط النانوي القائم على التغصنات في طريقة من ثلاثة جداول لمعالجة تأثير كثافة RGD المحلية على استجابة الخلية.
تحافظ الأنماط النانوية على التصاق الخلية بشكل أكثر كفاءة على السطح المتجانس المقابل المستخدم بشكل شائع في زراعة الخلايا. في تجارب التمايز ، فضلت الالتصاق الوسيط للخلايا بالركيزة تكثيف الخلايا الوسيطة والتمايز الزمني المبكر. نظرا لسهولة تعديل النمو المحيطي للتغصنات ، يمكن توسيع الطريقة الموصوفة هنا إلى جميع الطبقات الروماتيزمية المفرطة التي لها تأثيرات كثافة على الخلايا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
تصف هذه المقالة طريقة للحصول على أنماط نانوية غير متساوية مستندة إلى الدندريم التي تسمح بالتحكم على نطاق النانو في كثافة سطح الأرجينين-جلايسين-حمض الأسبارتيك (RGD) المحلي. يتم تطبيق التقنية لدراسة التصاق الخلايا والتمايز الغضروفيّ.
This method enables nanoscale control of RGD surface density to modulate cell adhesion and chondrogenic differentiation, addressing a key challenge in biomaterials design for tissue engineering. By providing a scalable approach to create uneven nanopatterns, it supports mechanistic de-risking in early discovery by linking ligand presentation to functional cellular outcomes. The technique offers predictive value for screening biomaterials that influence mesenchymal stem cell behavior in cartilage repair applications.
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to preclinical evaluation of biomaterials for tissue regeneration, particularly where nanoscale ligand presentation influences cell fate.