في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

الهدف العام لهذا البروتوكول لمقايسة التحويل الناجم عن الارتعاش في الوقت الفعلي هو السماح بالكشف الحساس عن بريونات مرض الهزال المزمن في عينات براز عنق الرحم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث CWD مثل وقت إصابة عنق الرحم CWD في البراز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها محددة وحساسة وتتيح إنتاجية عالية للعينات.

ستظهر الإجراء جيني تشنغ ، فني مختبر من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، أضف جراما واحدا من مادة البراز إلى أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من مستخلص البراز. باستخدام مفكك مع برنامج محدد مسبقا للبروتينات ، قم بتجانس الكريات البرازية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كرر هذا مرتين إلى ثلاث مرات حتى تتجانس عينات البراز تماما. ثم استخدم البارافيلم لإغلاق الأنابيب ووضعها على منصة هزاز أو شاكر دوار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 18 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اجمع المواد الطافية وقم بتقسيمها إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. يحفظ على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للاستخدام. لبدء طريقة ترسيب حمض فوسفوتنجستيك الصوديوم ، أضف 250 ميكرولتر من ساركوسيل إلى مليلتر واحد من مستخلص البروتين البرازي.

باستخدام البارافيلم ، أغلق الأنبوب. ضع الأنبوب في خلاط حراري واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مستمر عند 1،400 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف محلول مخزون يحتوي على 10٪ حمض فوسفوتنجستيك الصوديوم و 170 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم بحيث يكون التركيز النهائي لحمض فوسفوتنجستيك الصوديوم في العينات 3٪ انقل العينات إلى الخلاط الحراري واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع اهتزاز مستمر عند 400 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 15 ، 800 جم لمدة 30 دقيقة عند 14 درجة مئوية. قم بإزالة المواد الطافية بعناية واغسل الكريات عن طريق تعليقها في مخزن الغسيل. ثم جهاز الطرد المركزي عند 15 ، 800 جم لمدة 15 دقيقة عند 14 درجة مئوية.

قم بإزالة المواد الطافية بعناية وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف RT-QuIC. قم بتخزين العينات المعالجة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لإجراء اختبار RT-QuIC. للبدء ، أضف 0.032 جرام من ثيوفلافين تي إلى 10 مل من الماء المقطر المزدوج لتحضير محلول مخزون Thioflavin T الطازج 10 ملليمول.

بعد ذلك ، استخدم الماء المقطر المزدوج لعمل تخفيف من 1 إلى 10 من محلول المخزون مما ينتج عنه تركيز نهائي من مليمولر واحد ثيوفلافين T.باستخدام حقنة مجهزة بفلتر قرص Acro 0.2 ميكرومتر ، قم بتصفية محلول Thioflavin T المليمولي الواحد. ثم قم بإذابة ركيزة بروتين البريون الأكثر مؤتلفة. قم بتحميل 500 ميكرولتر من ركيزة بروتين البريون المؤتلف في المرة الواحدة في 100 كيلو من الأنابيب الدقيقة لمرشح استبعاد حجم دالتون.

جهاز طرد مركزي عند 14 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، انقل الركيزة المملوطة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإذابة المخزن المؤقت للتخفيف RT-QuIC المخزن. قم بتخفيف البذور وإعداد محاليل المخزون وخليط تفاعل RT-QuIC كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام ماصة بطرف مرشح، امزج خليط التفاعل عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.

يسكب المزيج في خزان ماصة للتخلص من 50 ملليلتر. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتحميل 98 ميكرولترا من خليط تفاعل RT-QuIC في كل بئر من اللوحة السفلية البصرية ذات 96 بئرا. إلى كل تفاعل ، أضف ميكرولترين من مستخلص البروتين البرازي غير المخفف أو 10 أضعاف المخفف متسلسلا.

ثم استخدم شريط مانع للتسرب لإغلاق اللوحة. احتضن في قارئ الألواح عند 42 درجة مئوية لمدة 25 ساعة مع دورات متكررة مدتها دقيقة واحدة من الاهتزاز المداري المزدوج عند 700 دورة في الدقيقة ودقيقة واحدة من الراحة طوال فترة الحضانة. وفي الوقت نفسه ، حدد إعدادات قياس التألق كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد 25 ساعة ، قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة. قم بتدوير اللوحة عند 3 ، 000 جم لمدة ثلاث دقائق لتجنب التلوث المحتمل بين الآبار. بعد ذلك ، قم بإزالة الختم من اللوحة.

قم بإعداد لوحة جديدة عن طريق إضافة 90 ميكرولترا من خليط تفاعل RT-QuIC الذي يحتوي على ركيزة جديدة وصبغة مضان Thioflavin T طازجة. انقل 10 ميكرولتر من كل بئر من اللوحة الأولى إلى اللوحة المعدة حديثا المكونة من 96 بئرا. استخدم شريط مانع للتسرب لإغلاق اللوحة الجديدة.

بعد تحديد إعدادات قياس التألق ، استمر في الاختبار لمدة 50 ساعة إضافية. اقرأ وتوثيق إشارة Thioflavin T المضان لكل بئر كل 15 دقيقة. ثم اجمع البيانات ورسمها كما هو موضح في بروتوكول النص.

في هذه الدراسة ، يتم تجانس المواد البرازية من الأيائل أو الغزلان البغل غير المصابة في مخزن مستخلص البراز للحصول على تركيز عينة نهائي بنسبة 10٪ ثم تتم معالجة بعض المتجانسات وتركيزها 10 مرات بواسطة ترسيب حمض فوسفوتنجستيك الصوديوم. بينما لوحظ انخفاض في التحويلات التلقائية في العينات المنقاة ، أظهرت جميع العينات إشارات مضان منخفضة في عينات البراز الموجبة CWD. لتحسين تضخيم البريونات وتعزيز حساسية الكشف ، يتم دمج خطوة استبدال الركيزة.

العينات التي خضعت لاستبدال الركيزة كجزء من بروتوكول RT-QuIC زيادة في حساسية وخصوصية الكشف حيث كانت 14 من 18 عينة إيجابية ولم يتم تسجيل أي من الضوابط السلبية على أنها إيجابية كاذبة. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير مستخلص البراز وتركيز PRP / SCRP في حوالي أربع ساعات ويمكن إعداد اختبار RT-QuIC في حوالي 1 / 1-2 ساعة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصفية الركيزة ولكن لا تقم بدوامها أبدا.

بعد الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل النشاف الغربي للإجابة على أسئلة إضافية مثل مدى مقاومة البروتياز للمنتجات الناتجة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للعلماء في مجال أبحاث البريون لاستكشاف وجود البريونات في الحية من خلال اختبار عينات البراز. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتركيز PRP / SCRP من المستخلصات البرازية وكيفية إجراء اختبار RT-QuIC المعدل للحصول على اكتشاف البريون الحساس والمحدد.

لا تنس أن العمل مع البريونات يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه من المهم ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل تحت خزانة السلامة الحيوية أثناء تنفيذ الإجراء.