تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

الهدف العام من هذه الطريقة هو تنقية فيروس الهربس البسيط من النوع الأول من الخلايا المصابة للتحليل البروتيني للبروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسي. توفر هذه الطريقة رؤى رئيسية حول تورط العوامل الخلوية وعدوى فيروس الهربس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تكييفها لتنقية مجموعات مختلفة من الحمض النووي الفيروسي مباشرة من الخلايا المصابة ، مما يسمح بتحليل جوانب متعددة من العدوى.

ابدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا MRC الخمس كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بتخفيف HSV-1 في محلول ملحي بارد أو TBS. بالنسبة للخطوات التالية ، من المهم إيقاف تشغيل المنفاخ وغطاء مزرعة الأنسجة لمنع الخلايا من الجفاف.

استخدم ماصة لنقل وسط النمو من خلايا MRC 5 إلى زجاجة معقمة لإضافتها مرة أخرى إلى الخلايا بعد الإصابة. إصابة الخلايا بإضافة سبعة ملليلتر من الفيروس المخفف إلى الخلايا. هز الخلايا كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الامتصاص ، استنشق البطاء ، واشطف الخلايا ب 50 مل من درجة حرارة الغرفة TBS واستبدل وسط النمو الأصلي. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد بداية تكرار الحمض النووي الفيروسي ، بعد حوالي أربع ساعات من الإصابة ، قم بتسمية تكرار الحمض النووي الفيروسي.

للقيام بذلك ، قم بتخفيف EdC في مليلتر واحد من وسط النمو وإضافته إلى وسط زراعة الخلايا للخلايا المصابة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. لحصاد النوى ، استبدل وسط النمو ب 20 مل من المخزن المؤقت لاستخراج النوى واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع التأرجح العرضي. بعد الحضانة ، اكشط النوى من اللوحة باستخدام مكشطة الخلية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد.

جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2 ، 500 × جم وأربع درجات مئوية لحبيبات النوى. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. قم بإزاحة الحبيبات النووية برفق في 10 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات أو PBS وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم ، قم بالطرد المركزي للعينة كما كان من قبل. بعد إزالة PBS تماما ، أعد تعليق الحبيبات النووية في 10 ملليلتر من مزيج تفاعل النقر ، عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل خمس مرات باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر. قم بتدوير العينة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية ، قبل تكوير النوى كما كان من قبل.

قم بإزالة مزيج التفاعل السريع تماما ، ثم اغسل الحبيبات عن طريق إعادة تعليقها برفق في 10 مل من PBS والطرد المركزي مرة أخرى. الآن ، أعد تعليق الحبيبات النووية بعناية في مليلتر واحد PBS وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة PBS تماما وتجميد الحبيبات في النيتروجين السائل.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الحبيبات عند 80 درجة مئوية أو يمكن متابعة الإجراء. لتحلل النوى وتفتيت الحمض النووي ، أعد تعليق النوى المذابة في 500 ميكرولتر من Buffer B1 عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضن المعلق على الجليد لمدة 45 دقيقة.

بعد ذلك ، صوتنة العينات ست مرات لمدة 30 ثانية لكل منها بسعة 40٪ ، باستخدام مسبار microtip ثلاثة ملليمترات. ضع العينات على الجليد لمدة 30 ثانية على الأقل بين النبضات. بعد الصوتنة ، يجب أن تبدو العينات واضحة وليست غائمة.

قم بتكسير حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 14،000 × جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. يجب أن ينخفض حجم الحبيبات بشكل كبير ، وتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون والاحتفاظ بالتدفق من خلالها. ثم أضف 500 ميكرولتر من Buffer B2 إلى المادة المطفية المفلترة.

لربط الحمض النووي الحيوي بالخرز المطلي بالستربتافيدين ، قم بإعداد حبات الستربتافيدين المغناطيسية عن طريق نقل 300 ميكرولتر من ملاط الخرز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. تحضير أنبوب واحد من الخرز لكل عينة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مليلتر من Buffer B2 عن طريق الدوامة لإعادة التعليق ، وتطبيقها على مغناطيس لفصل الخرزات وشفط مخزن الغسيل المؤقت.

ثم أضف 900 ميكرولتر من العينة إلى الخرز المغسول. سيتم استخدام ما تبقى من العينة لعزل الحمض النووي والبروتين. قم بتدوير التعليق طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، ضع العينات في رف أنبوب مغناطيسي للطرد الدقيق وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخرزات برفق في مليلتر واحد من Buffer B2 ، قبل الدوران عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية مرة أخرى باستخدام رف أنبوب الطرد الدقيق المغناطيسي.

هذه المرة ، أعد تعليق الخرزات برفق في مليلتر واحد Buffer B3 وقم بتدويرها عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية من خليط الخرز باستخدام المغناطيس ، أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لعينة Laemmli 2x للتلميح إلى مجمعات بروتين الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

دوامة مزيج قبل تدوير العينات بسرعة في ميكروفوج. ضع العينات على المغناطيس وانقل التخصيص إلى أنبوب جديد. أخيرا ، قم بتجميد العينات وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية.

قم بإجراء تحليل البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. تم إجراء وضع العلامات على EdC لمدة صفر أو 20 أو 40 أو 60 دقيقة متبوعا بتنقية الحمض النووي الفيروسي والبروتينات المرتبطة به. تعرضت البروتينات المملوءة لتلوين coomassie الأزرق والنشاف الغربي بالجسم المضاد الخاص ببروتينات ربط الحمض النووي الفيروسي ، ICP4 و UL42.

يشير السهم إلى الستربتافيدين الذي تم تجريده من الخرز أثناء الشطف وهو موجود في جميع الظروف. ثم تخضع البروتينات المعزولة بهذه الطريقة لقياس الطيف الكتلي. يوضح المخطط الدائري عدد البروتينات في كل فئة وظيفية التي وجد أنها مرتبطة بنوع فيروس الهربس البسيط على الجينومات بعد ست ساعات من الإصابة.

تم إجراء نظرة فاحصة على تفاعلات البروتين والبروتين بين البروتينات المحددة باستخدام قاعدة بيانات شبكة ارتباط البروتين الوظيفي السلسلة. تكشف النتائج عن مجمعات فرعية من البروتينات التي تعمل معا في نفس العملية البيولوجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة للتحقيق البروتيني للبروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسي.

يمكن إكمال هذه التقنية في ثلاثة إلى أربعة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع تلوث الحمض النووي أو البروتياز للعينات. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي للتحقق من طبيعة الحمض النووي الفيروسي المسمى EdC.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم فيروسات الهربس ، لاستكشاف وظائف البروتينات المضيفة والعدوى الفيروسية.