شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

ابدأ هذا الإجراء بتحضير الخلايا الليفية في وتر الفأر ، كما هو موضح في بروتوكول النص. احصد الخلايا من صفيحة طولها 10 سم عن طريق شفط الوسائط أولا. ثم أضف ملليلترا واحدا من 0.05٪ تريبسين EDTA واحتضنه لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، قم بإخماد التربسين بتسعة ملليلتر من DMEM-10 ، واجمع الخلايا المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. تمييع الخلايا باستخدام DMEM-10 إلى تركيز نهائي من خلية واحدة لكل 100 ميكرولتر. ثم انقل الخلايا إلى 96 لوحة بئر عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المعلق في كل بئر.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تتلاقى الآبار ، الأمر الذي قد يستغرق ما يصل إلى أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. استبدل الوسائط ب DMEM-10 الطازج كل ثلاثة إلى خمسة أيام. عند التقاء ، قم بتعبئة الخلايا ب 20 ميكرولتر 0.05٪ تريبسين EDTA لكل بئر ، وقم بتقسيمها إلى مجموعتين مكررتين من 96 لوحة بئر.

فحص نشاط لوسيفيراز في مجموعة واحدة من اللوحات. استخدم مقايسة لوسيفيراز Firefly المتجانسة التي لا تتطلب إزالة الوسائط ، باتباع البروتوكول المضمن في مجموعة مقايسة luciferase. استخدم نتائج الفحص لتحديد المستنسخة التي لا يوجد بها نشاط لوسيفيراز يمكن اكتشافه من مجموعة اللوحات المتبقية.

قم بتوسيع هذه المستنسخة أولا إلى صفيحة 24 بئرا ، ثم إلى صفيحة من ستة آبار. قم بإجراء نفس الشيء مع استنساخ مع أعلى نشاط لوسيفيراز. سيتم استخدام هذا كعنصر تحكم إيجابي لأغراض التحقق من الصحة.

بعد التوسع في صفيحة الآبار الستة ، احصد حصة من كل بئر للحصول على لطخة غربية. تعبئة الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين EDTA. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

قم بإخماد الخلايا بملليلترين من DMEM-10 ، وانقل نصف الخلايا إلى ستة ألواح أخرى من الآبار. انتظر حتى تلتصق الخلايا بأسفل اللوحة. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS قبل التحلل من أجل اللطخة الغربية.

قم بتركيب العديد من المستنسخة السالبة في 0.2 مليون خلية لكل بئر في صفيحة من ستة آبار. عالج الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 ميكرومولار 5-أزاسيتيدين. ثم احتضن لمدة 72 ساعة دون تغيير الوسائط قبل فحص نشاط لوسيفيراز ، كما كان من قبل.

بعد ذلك ، اختر استنساخا سلبيا واحدا اكتسب نشاط لوسيفيراز مع 5-azacytidine للشاشة ، وابدأ في توسيعه إلى عدة ألواح يبلغ طولها 10 سم. قم بتجميد المستنسخة السالبة المتبقية في النيتروجين السائل كنسخة احتياطية. يمكن الحفاظ على الاستنساخ الإيجابي في مزرعة الأنسجة أو تجميده حتى الاستخدام الآخر.

في الصباح ، ضع مليون خلية X غير نشطة على ألواح زراعة الأنسجة التي يبلغ طولها 10 سم. في فترة ما بعد الظهر ، قم بإصابة الألواح عن طريق استبدال الوسائط ب DMEM-10 الطازج الذي يحتوي على كمية محددة مسبقا من المادة الطافية الفيروسية وخمسة إلى 10 ميكروغرامات لكل مليلتر من البوليبرين. بعد 18 إلى 24 ساعة ، قم بشفط الوسائط وأضف 10 مل من DMEM-10 الطازج إلى كل طبق.

لوحات الثقافة لمدة 48 ساعة أخرى. في الصباح ، قم بتعبئة الخلايا باستخدام مليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA لكل طبق ، وقم بإخماد الخلايا ب 9 ملليلتر من DMEM-10 لكل لوحة. قم بتشغيل التعليق من خلال مرشح شبكي 100 ميكرون.

اسحب المعلقات المفلترة معا ، وقم بزرع مجموعتين من الألواح التي يبلغ طولها 10 سم بمليون خلية لكل لوحة. في فترة ما بعد الظهر، استبدل الوسائط الموجودة في مجموعة واحدة من الألواح ب DMEM-10 التي تحتوي على 15 ميكروغراما لكل مليلتر من Hygromycin B.In المجموعة الأخرى، واستبدل الوسائط ب DMEM-10 الطازج فقط. بعد 48 ساعة ، قم بتعبئة الخلايا من ألواح Hygromycin B غير المعالجة باستخدام مليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA.

احتضن لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإخماد الخلايا ب 9 ملليلتر من DMEM-10. اسحب العينات الفردية ، واستمر على الفور في استخراج الحمض النووي.

استمر في زراعة مجموعة اختيار Hygromycin B لمدة ستة أيام أخرى ، وتجديد وسائط الاختيار ب DMEM-10 الطازج الذي يحتوي على Hygromycin B كل يومين. في اليوم السادس، استبدل وسائط الاختيار ب DMEM-10 الطازج فقط. انتظر أربعة أيام للتعافي ، ثم قم بحصاد الحمض النووي لعينة ما بعد الاختيار كما كان من قبل.

تابع تحديد دبابيس الشعر المخصبة في عينات ما بعد الاختيار ، كما هو موضح في بروتوكول النص. للتحقق من صحة الضربات ، قم أولا بزرع ثمانية ملايين خلية بحجم 293 قدما لكل لوحة على ألواح بطول 10 سم. في اليوم التالي، استبدل الوسائط بتسعة ملليلتر من DMEM-10 الخالي من المضادات الحيوية لكل طبق قبل 30 دقيقة من التقطيع.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من التعداء ، امزج واحدا إلى كل حصة من مزيج التعداء ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات. ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ضعي الخليط على كل طبق بطريقة قطرية ، وحركي الطبق برفق حتى يمتزج.

في اليوم التالي ، استبدل الوسائط بخمسة ملليلتر من DMEM-10.48 ساعة بعد التعدي الأولي ، واجمع المادة الطافية الفيروسية ، وقم بتشغيلها من خلال مرشح 0.22 ميكرون تم تبطيله مسبقا باستخدام DMEM-10 لتحقيق أقصى قدر من التعافي. في صباح اليوم التالي ، قم بوضع 0.1 مليون خلية X غير نشطة لكل بئر على ستة ألواح بئر. في فترة ما بعد الظهر ، قم بإصابة الألواح عن طريق استبدال الوسائط بملليلترين من DMEM-10 الطازج الذي يحتوي على مادة طافية للفيروسات وخمسة إلى 10 ميكروغرامات لكل مليلتر من البوليبرين.

يصيب بئر التحكم بمادة طافية فيروسية منتجة من ناقل فيروسي عدسي فارغ. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط بملليلترين من DMEM-10 تحتوي على ملليغرام واحد لكل مليلتر من بورومايسين. استخدم التحديد لمدة أربعة أيام.

بعد أربعة أيام ، استبدل الوسائط بملليلترين من DMEM-10 الطازج ، واترك 48 إلى 72 ساعة للتعافي. بعد تعبئة الخلايا ب 150 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين EDTA ، احتضنها لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإخماد الخلايا ب 1.5 مل من DMEM-10 قبل نقلها إلى أنابيب مخروطية الشكل والطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة عند 500 مرة G لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المتوفرة في مجموعة فحص لوسيفيراز. احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، انقل التعليق إلى لوحة بيضاء 96 بئر.

قم بإجراء الفحص في الغرفة المظلمة ، باتباع البروتوكول المضمن في المجموعة. استخدم الخلايا X النشطة كعنصر تحكم إيجابي والخلايا X السالبة المصابة بناقل فيروسي فارغ كعنصر تحكم سلبي. تظهر استنساخ الخلايا الليفية لأوتار الفأر الخالدة نشاطا إيجابيا أو سلبيا لوسيفيراز Firefly ، بما يتفق مع وضع المراسل على الكروموسوم X النشط أو غير النشط ، على التوالي.

يظهر تعبير MeCP2 ، كما تحدده اللطخة الغربية ، النمط المتبادل. لاحظ أن نشاط لوسيفيراز اليراع يمكن إحداثه في المستنسخة السلبية مع إعطاء 5-azacitidine. إذا كان موجودا على الكروموسوم X النشط ، فإن جين مقاومة Hygromycin يمنح ميزة البقاء على قيد الحياة في ظل اختيار Hygromycin ، عند مقارنته بالخلايا التي تحتوي على الجين الموجود على كروموسوم X غير النشط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتنفيذ شاشة لمنظمي تعطيل الكروموسوم X باستخدام المراسلين الذين يتم إدخالهم بشكل انتقائي على كروموسوم X غير النشط. أجرى مختبري سابقا شاشات قاعدة تم الإبلاغ عنها لمنظمات الكروماتين في الخميرة ، وقد ألهمني نجاحنا في هذا النهج لتصميم هذه الشاشة لمنظمات تعطيل الكروموسوم X في خلايا الثدييات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل ، كريسبر ، الجزيئات الصغيرة للمساعدة في الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتعطيل الكروموسوم X في خلايا الثدييات.