رقاقة المستندة إلى خلية ثقافة ثلاثي الأبعاد في المفاعلات الصغيرة Perfused

مرحباً، أنا إريك غوتوالد، باحث علمي في معهد الواجهات البيولوجية التابع لمعهد وير للتكنولوجيا. وأود اليوم أن أقدم لكم نظامنا الميكروي النشط بيولوجياً والمستند إلى الشريحة والتدفق المستمر. وقبل أن نتمكن من استخدام الشريحة في تطبيقات المزارع الخلوية، يتعين علينا إجراء تحلل مائي للبوليمر وإزالة الغشاء من المنطقة ذات البنية الميكروية.

يتم تحقيق ذلك ببساطة عن طريق غمس الشريحة في تركيزات مختلفة من isopropanol، بدءاً بـ 100%. أقوم بغمس الشريحة لبضع ثوانٍ فقط في كل تركيز، وتكون الخطوة النهائية هي الماء فقط. بعد ذلك، يتم تجفيف الشريحة، وفي النهاية يجب تغطية الشريحة بمحلول collagen, one لتسهيل التصاق الخلايا بالبوليمر. يتم ذلك عن طريق وضع بضع قطرات فقط من محلول collagen, one فوق المنطقة ذات البنية المجهرية، وفي هذه الحالة، يتم تحضين الشريحة عند 4 °C طوال الليل.

بعد التحضين طوال الليل مع محلول الكولاجين 1، يتم إزالة المحلول وغسل الشريحة باستخدام PBS معقم. بعد ذلك، يتم أيضًا إزالة PBS وتصبح الشريحة الآن جاهزة لتلقيح الخلايا. والآن سنقوم بتلقيح شريحة الخلايا بمعلق من الخلايا المفردة، ويتم ذلك ببساطة عن طريق وضع 150 µL من معلق الخلايا فوق المنطقة ذات البنية المجهرية. وبعد ترسيب الخلايا، يتم تحضين الشريحة لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C في حضانة.

بعد فترة الحضانة التي استمرت ثلاث ساعات، تُخرج الشريحة من الحاضنة وتصبح الآن جاهزة للإدخال في الـ ector. وللقيام بذلك، يتم إخراج الـ ector من عبوته المعقمة، حيث يتم تحقيق التعقيم عن طريق التشعيع بغاما لهذا الغشاء الشفاف. لذا، كل ما علينا فعله هو فتح العبوة وإخراج الـ ector.

ما سنقوم به تالياً هو إدخال الجزء العلوي من الزجاجة في خزان الوسط هذا حتى نتمكن من تفكيك غلاف المفاعل الحيوي لإدخال الشريحة. بعد فتح غلاف المفاعل الحيوي، يمكننا الآن إدخال الشريحة، ويتم ذلك ببساطة عن طريق وضع الشريحة في أخدود غلاف المفاعل الحيوي، ومن ثم يمكن تجميع المفاعل الحيوي مرة أخرى. الخطوة النهائية التي يجب القيام بها هي توصيل مرشحين معقمين بخزان الوسط ومنفذ أخذ عينات معقم واحد.

لقياس الضغط الجزئي الفعلي للأكسجين في حلقة التدوير المغلقة، سنقوم بإدراج مستشعرين للأكسجين عن طريق تركيبهما ببساطة بين هذين الموصلين. أصبح الـ bactor الآن جاهزاً للتعبئة بوسط الزرع. أصبح نظام الـ bactor الآن جاهزاً ليتم تعبئته بوسط زراعة الخلايا، ويتم تحقيق ذلك ببساطة عن طريق توصيل حلقة التدوير المغلقة بالمضخة الأسطوانية.

بهذه الطريقة، سنقوم بتفريغ الدورة الدموية لـ bactor بالكامل في وقت واحد. كما تلاحظون هنا في نافذة Ector، يمكنكم رؤية الوسط وهو يصعد من الأسفل ويرتفع تدريجياً، ويخرج من bactor من الأعلى. وقبل وضع نظام Bactor في الحاضنة، نتحقق من ملء حلقة الدورة بدون فقاعات.

الآن أصبح النظام مملوءاً بالكامل بوسط استزراع الخلايا، ويمكننا نقل المفاعل الحيوي إلى الحاضنة. سنقوم الآن بوضع المفاعل الحيوي داخل غرفة التحضين. ولهذا الغرض، يتم أولاً توصيل المفاعل الحيوي بالمضخة الأسطوانية، كما رأيتم قبل قليل، والآن يتم تروية المفاعل بشكل نشط بواسطة هذا الوسط من القارورة.

وللحفاظ على تركيز الأكسجين المحيط، نقوم بتوصيل خزان الوسط بإمدادات الغاز. وأخيراً، سنقوم بتوصيل مستشعرين للأكسجين بدورة التدوير لمراقبة مستوى توتر الأكسجين في النظام مباشرة. الآن أصبح الإعداد مكتملاً ويمكن تشغيله للمدة التي صممتها للتجربة.

تعد المجهر المسحي الليزري، الذي يمكنكم رؤيته هنا، أحد أقوى الأدوات المستخدمة أثناء تحليل الوظائف النسيجية العضوية للخلايا داخل حاويات MicroCon. يمنحنا المجهر المسحي الليزري الفرصة لفحص كل حاوية MicroCon على حدة دون إتلافها. وبما أن حاويات MicroCon أو الشريحة يمكن استخدامها في طرق التلوين المناعي التقليدية وطرق التألق المناعي، فإننا قادرون على اكتشاف جميع أنواع المؤشرات والوظائف النسيجية العضوية داخل الحاويات الدقيقة.

كما ترون هنا، في الرسوم المتحركة لهذه الشريحة، فإن القاع ممتلئ تماماً بالخلايا، وكذلك جدران حاوية MicroCon. لدينا وفرة من الخلايا الحية، مع وجود عدد قليل جداً من الخلايا الميتة. وتوضح الصورة التالية أنه يمكننا اكتشاف جميع أنواع الوظائف النمطية للعضو (organotypic functions) داخل حاوية MicroCon.

على سبيل المثال، بالنسبة للخلايا الكبدية، يمكن ملاحظة إنتاج الألبومين أو تعبير E-cadherin في الخلايا، وهو ما يظهر هنا بوضوح في الصورة المتراكبة. صُبغت النواة باللون الأزرق، وصُبغ E-cadherin باللون الأخضر، بينما عُبر عن الألبومين أو صُبغ باللون الأحمر.

وكما تلاحظون هنا بوضوح، فإن جميع الوظائف النسيجية المتوقعة من الخلايا الكبدية يتم التعبير عنها بشكل جيد في هذا النوع من المزارع ثلاثية الأبعاد. علاوة على ذلك، قمنا بفحص مؤشر آخر للخلايا الكبدية، وهو cytokeratin 18، وتوضح هذه الصورة أن Cytokeratin 18 يتم التعبير عنه بشكل جيد أيضاً في هذا النوع من المزارع. ونأمل أن يقنعكم هذا بأن هذا النوع من الوظائف النسيجية قد يكون مفيداً لمزارع نسيجية أخرى أيضاً.

بعد انتهاء تجربة Biore، يمكن استخدام الشريحة لعزل جميع أنواع المكونات الخلوية، مثل الـ RNA الكلي على سبيل المثال. وكما ترون هنا، فإننا نعرض لكم الـ RNA الكلي الذي تم عزله من نظام المفاعل الحيوي. يمكن بعد ذلك استخدام هذا الـ RNA الكلي في تطبيقات لاحقة، مثل الـ PCR في الوقت الحقيقي (realtime PCR)، أو كما ترون هنا، تحليل المصفوفات الدقيقة (microarray analysis).

علاوة على ذلك، يمكن عزل خلايا سليمة من النظام، ومن ثم استخدام هذه الخلايا في تحليل قياس التدفق الخلوي التقليدي. وكما ترون هنا، آمل أن نكون قد أوضحنا لكم أن هذا النظام قد يكون مفيداً لجميع أنواع التطبيقات التي تتطلب تفاعلات نموذجية عضوية، وأنه قد يكون مفيداً أيضاً لكافة أنواع التطبيقات التي لم نتناولها حتى الآن، مثل تطبيقات الخلايا الجذعية على سبيل المثال.