مكتبة الببتيد المتداخلة لتعيين سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد حواتم Qa-1 في البروتينات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم المناعة والعلاج المناعي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الببتيدات المعينة معروفة بتحفيز خلايا CD8 T المقيدة ب Qa-1 ، والإجراء سهل التنفيذ.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى التصميمات العلاجية للأمراض المناعية ، مثل التصلب المتعدد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التنظيم المناعي بوساطة Qa-1 في ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تنظيم المناعة بوساطة HLA-E في البشر. لبدء الإجراء ، صمم مكتبة من الببتيدات 15 مير ، حيث تتداخل الببتيدات المجاورة في 11 من الأحماض الأمينية.

الحصول على الببتيدات وإعادة تشكيلها في ظل ظروف معقمة. لكل ببتيد ، امزج خمسة ملليغرام من الببتيد مع 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. امزج 10 ميكرولترات من كل مخزون ببتيد في أنبوب تبريد نظيف سعة 1 مليلتر لتحضير مخزون حمام السباحة OLP.

بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من كل مخزون ببتيد في صفيحة 96 بئر ذات قاع V ، وقم بتخفيف كل مخزون ب 80 ميكرولترا من الماء المعقم. قم بتخزين كل من مخزون الببتيد المتبقي البالغ 50 ملليغرام لكل مليلتر ولوحة 10 ملليغرام لكل مليلتر مخزون الببتيدات عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من محلول مخزون حمام السباحة OLP إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ملليلترين من الخلايا المتغصنة المشعة في وسط خال من المصل ، وبالتالي تخفيف DMSO مائتي ضعف.

قم بتخزين مخزون تجمع OLP المتبقي على حرارة 20 درجة مئوية. احتضن التيار المستمر مع مسبح OLP في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. رج الخلايا برفق كل 15 دقيقة باليد.

أثناء الحضانة ، استخدم مجموعة لتنقية خلايا CD8 + T من طحال الفأر أو الغدد الليمفاوية المحصودة. قم بإعداد خمسة ملليلتر من محلول يحتوي على 10 ملايين خلية تائية لكل مليلتر من الوسط الخالي من المصل مع 50 وحدة لكل مليلتر من الإنترلوكين 2 ، و 100 وحدة لكل مليلتر من الإنترلوكين 7. يجب أن تكون خلايا CD8 T المنقاة خالية من الخرز أو لم تمس.

ضع 0.5 مل من محلول الخلايا التائية في كل من 10 آبار من صفيحة 48 بئرا. بمجرد اكتمال حضانة محلول التيار المستمر النبضي بتجمع OLP ، أضف 10 ملليلتر من الوسط الخالي من المصل إلى DCs. الطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أعد تكوين الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط خال من المصل. أضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل من الآبار ال 10. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة أربعة أيام.

ثم قم بإزالة 400 ميكرولتر من وسط الثقافة من كل بئر. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الطازج الذي يحتوي على 100 وحدة لكل مليلتر لكل من IL-2 و IL-7 لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة يومين إلى ثلاثة أيام أخرى قبل إعادة تحفيز الخلايا المعدة لتجمع OLP.

قبل إعادة التحفيز ، احصل على الضامة البريتونية للفأر وتشعيعها. اضبط تركيز البلاعم على خمسة ملايين خلية لكل مليلتر من الوسط الخالي من المصل. امزج 10 ميكرولترات من مخزون حمام السباحة OLP مع ملليلترين من البلاعم البريتونية المشعة للحصول على تركيز DMSO نهائي بنسبة 0.5٪ من حيث الحجم.

استكمل هذا المحلول ب 100 وحدة لكل مليلتر من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم الفئران. املأ لوحا سعة 48 بئرا ب 200 ميكرولتر من محلول البلاعم OLP-pool في كل بئر. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

ثم اغسل كل بئر برفق ب 200 ميكرولتر من وسط RPMI-0 الدافئ مسبقا. سيحتوي محلول البلاعم على الكثير من الخرز. قبل إضافة خلايا CD8 T المعدة بتجمع OLP ، يجب فحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من خلو جميع الآبار من الخرز.

بعد ذلك ، قم بجمع وتجميع خلايا CD8 + T المعدة بتجمع OLP والجاهزة لإعادة التحفيز. اضبط تركيز الخلايا التائية على مليون خلية لكل مليلتر في وسط خال من المصل يحتوي على 25 وحدة لكل مليلتر من IL-2 ، و 50 وحدة لكل مليلتر من IL-7. أضف ملليلترا واحدا من محلول الخلايا التائية المجمعة إلى كل بئر يحتوي على البلاعم النبضية لتجمع OLP.

استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة أربعة أيام. ثم قم بإزالة حوالي 400 ميكرولتر من الوسط من كل بئر. أضف إلى كل بئر 500 ميكرولتر من الوسط الطازج الخالي من المصل الذي يحتوي على 100 وحدة لكل مليلتر لكل من IL-2 و IL-7.

استئناف الحضانة في نفس الظروف. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام ، افحص الخلايا المعاد تحفيزها بحثا عن استجابة مقيدة ل Qa-1 خاصة بتجمع OLP باستخدام مقايسة البقع المناعية المرتبطة بإنزيم الإنترفيرون جاما. قم بتحديث وسيط الخلايا التائية CD8 + كل ثلاثة إلى أربعة أيام أثناء انتظار النتائج.

قم بإجراء اختبار ELISPOT باستخدام مخزون الببتيد المخفف لتحديد الببتيدات التي تنتج إفراز الإنترفيرون جاما المقيد Qa-1 الخاص بتجمع OLP. أخيرا ، قم بتقييم سلسلة الببتيد المقطوعة باستخدام ELISPOT لتحديد حاتمة Qa-1 المثلى. أظهر اختبار إنترفيرون جاما ELISPOT زيادة كبيرة في الخلايا المكونة للبقع عندما تم دمج خلايا CD8 + T المحفزة بواسطة مكتبة الببتيد المتداخلة MOG المجمعة مع C1R.

خلايا Qa-1b. يشير هذا إلى أن الخلايا التائية استجابت لببتيدات ربط Qa-1 ، وأن MOG_pool تحتوي على واحد أو أكثر من حواتم ربط Qa-1. تم إجراء فحص آخر لفحص الببتيدات الفردية في المسبح.

أظهرت ثلاثة ببتيدات استجابات أكبر بثلاث مرات على الأقل من الاستجابة في وجود C1R. خلايا Qa-1b بدون الببتيدات. من بين هؤلاء ، تم اختيار الببتيد الذي يتمتع بأكبر استجابة لمزيد من التقييم.

تم تقييم مكتبة من الببتيدات المقطوعة بناء على الببتيد 15 مير ذي الأهمية لتحديد حاتمة Qa-1 المثلى. من الناحية المثالية ، سيكون الحتمة من ثمانية إلى 10 ميرات ، مع تفضيل تسعة مير. علاوة على ذلك ، ستظهر الحاتمة المثلى استجابة إنترفيرون جاما مماثلة أو أقوى من الببتيد 15 مير.

يناسب الببتيد المقطوع N النهائي تسعة mer N هذه المعايير بشكل أفضل ، مما يجعله حاتمة Qa-1 المثلى. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تنظيم المناعة لاكتشاف حواتم Qa-1 جديدة لدراسة تنظيم المناعة في الأنسجة الأخرى ، مثل البنكرياس. لا تنس أن العمل مع الإشعاع يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب على الباحثين اتباع السياسة المؤسسية بدقة وأن يتم تدريبهم بشكل مناسب.