إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا إلى مراحل مختلفة من دورة الخلية باستخدام الشطف بالطرد المركزي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علاجات السرطان. لأن عزل الخلايا إلى مراحل منفصلة ، يسمح باستجواب التأثيرات المعتمدة على الطور للمركبات المضادة للسرطان.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفصل الخلايا إلى مراحل محددة باستخدام الخصائص الفيزيائية ، بدلا من الاضطرابات الكيميائية. لبدء التجربة ، قم بتثبيت مجموعة الستروب في جهاز الطرد المركزي بحيث يتم تغذية سلك الطاقة من الغرفة من خلال المنفذ الموجود على اليسار. اضبط مصباح الفلاش القوي بحيث يصطف مع نافذة العرض، عند إغلاق جهاز الطرد المركزي.

قم بتثبيت المجموعة في مكانها ، عن طريق شد اثنين من مسامير رأس فيليبس ، في الجزء العلوي من كل قوس. ثم عن طريق شد مسامير الإبهام في الجزء السفلي من القوس. قم بتوصيل سلك الطاقة بمنفذ الطاقة القوي الموجود في الجزء الخلفي من جهاز الطرد المركزي.

بعد ذلك ، اضبط الدوارات لأسفل بشكل مستقيم على محور محرك الطرد المركزي ، وقم بتثبيتها بإحكام باستخدام مفتاح ربط سداسي بمقبض T. بعد ذلك ، ضع المجموعة التي تحتوي على غرفة الإزالة ، والموازنة ، ومجموعة الختم الدوارة ، ولوحة التثبيت على الدوار. ادفع لأسفل بالتساوي ، مع وضع يد واحدة على غرفة الإزالة ، واليد الأخرى على الميزان ، حتى تستقر البراغي الموجودة على الدوار في مكانها.

ضع الدبوس الموجود في أحد طرفي الكابل في الفتحة الموجودة في مجموعة مانع التسرب الدوار. وقم بتأمين ثقب العين ، في الطرف الآخر ، بأحد مسامير رأس فيليبس ، مثبتة على الحامل لتوصيل كابل التثبيت. لتجميع نظام التدفق ، لضخ المخزن المؤقت داخل وخارج غرفة الإزالة ، قم بتوصيل أنبوب بحجم 16 بمضخة متغيرة السرعة.

أدخل طرفا حرا واحدا من هذا الأنبوب من خلال منفذ في الجزء العلوي الأيسر من غرفة الطرد المركزي ، بحيث يدخل إلى الغرفة. قم بتوصيل تركيب بالطرف الحر لهذا الأنبوب ، ثم أدخل التركيب في فتحة الإدخال لمجموعة مانع التسرب الدوار. أخيرا ، أدخل أنبوب الإخراج ، من خلال منفذ ، لتثبيته بأنبوب النقل في الجزء العلوي من مجموعة مانع التسرب الدوار.

بمجرد تجميع نظام الإزالة ، قم بتعقيمه عن طريق وضع الطرف الحر الآخر من أنبوب الإدخال في زجاجة سعة 500 مل ، مملوءة بمواد التبييض بنسبة 5٪. ووضع أنبوب الإخراج في زجاجة نفايات فارغة سعة لتر واحد. بعد ذلك ، قم بتشغيل المضخة ، واترك المبيض يتدفق بالكامل عبر نظام الإزالة ، حتى يتم ضخه في زجاجة النفايات.

الآن ، قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي واسمح له بالوصول إلى السرعة القصوى المحددة لتحرير الفقاعات والضغط الخلفي. بمجرد الوصول إلى السرعة المحددة ، أوقف جهاز الطرد المركزي. بعد توقف الدوار تماما ، افتح الغطاء وافحص الغرفة بحثا عن أي تسريبات.

بعد ذلك ، بطريقة مماثلة ، كما هو موضح سابقا ، قم بتشغيل الماء المعقم عبر النظام لمدة 10 دقائق. بعد التنظيف بالماء ، استبدل خزان المياه بزجاجة زجاجية معقمة مملوءة ب 100 مل من محلول الشطف. ضع أنبوب الإدخال في هذه الزجاجة ، بحيث يكون في الأسفل.

ابدأ تشغيل جهاز الطرد المركزي ، واترك المخزن المؤقت يتدفق عبر النظام. بعد أن تقترب زجاجة الخزان من الفراغ ، ويتم طرد الماء بالكامل من النظام ، انقل أنبوب الإخراج من زجاجة النفايات إلى الخزان بحيث يتم إعادة تدوير المخزن المؤقت باستمرار من خلال النظام. أخيرا ، قم بتشغيل المصباح القوي ، وأدر مقبض الإزالة إلى أقصى اليسار.

الآن ، اضبط نافذة العرض عن طريق تدوير المقبض ببطء إلى اليمين ، بحيث ترى غرفة الإزالة بوضوح ، ويكون الضوء القوي متزامنا مع سرعة الدوار. قم بإعداد عينة الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف الخلايا المعلقة إلى زجاجة الخزان التي تحتوي على المخزن المؤقت لإعادة التصفية.

اسمح للخلايا بالدخول إلى النظام والوصول إلى التوازن داخل غرفة التصفية. للتأكد من الاحتفاظ بجميع الخلايا في الغرفة ، خذ قطرة من الطلاء على شريحة زجاجية ، واعرضها تحت المجهر. إذا كانت العينة خالية من الخلايا السليمة ، فإنها تؤكد الاحتفاظ بها في الغرفة.

بمجرد دخول جميع الخلايا إلى الغرفة ، ورؤية حدود مميزة في الجزء الأكثر بياضا من الغرفة ، تحتوي على خلايا وتوازن ، ابدأ في جمع الكسور. انقل أنبوب الإخراج إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 50 مليلتر مبرد مسبقا ، يسمى W1. اجمع 50 مل من محلول الإزالة في هذا الأنبوب وقم بتخزينه على الثلج. بعد فترة وجيزة من جمع جزء W1 ، قم بخفض سرعة جهاز الطرد المركزي إلى 821 G. وانقل أنبوب الإخراج إلى الأنبوب المخروطي ، المسمى W2 ، واجمع 50 مل أخرى بهذه السرعة.

استمر في تغيير السرعة وجمع الكسور. تأكد من وجود وسيط في خزان الخزان ، وقم دائما بتخزين الكسور المجمعة على الجليد. بعد جمع جميع الكسور ، أوقف جهاز الطرد المركزي ، واجمع 50 مل في أنبوب مخروطي الشكل ، يسمى توقف.

تم جمع خلايا الحبيبات في كل جزء من الكسر, وباستخدام تحليل المصب ، مثل قياس التدفق الخلوي ، أو النشاف الغربي ، حسب الحاجة. يظهر رسم بياني خطي يعرض متوسط قطر الخلايا في كسور الشطف المتتالية. لاحظ أنه كلما زاد قطر الخلية ، زاد عدد الكسر الذي تميل إليه.

تظهر نتائج تحليل فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت محتوى الحمض النووي للخلايا في كل جزء من أجزاء الإزالة ال 20. تحتوي الكسور المبكرة ، F1 إلى F5 ، على خلايا حصرية تقريبا تحتوي على محتوى 2N DNA يمثل الخلايا في مرحلة G1. شوهد خليط من الخلايا في مرحلتي G1 و S في الكسور الوسيطة ، F6 إلى F9. ولوحظت الخلايا التي تحتوي على محتوى 4N DNA ، والتي تمثل الخلايا في G2 إلى M ، بدءا من F10.

كما هو موضح هنا ، هي نتائج اللطخة الغربية من فحص مستويات البروتينات المرتبطة بدورة الخلية في الكسور المجمعة من الخلايا في مرحلة G1 ، و G2 إلى المرحلة M. كان لدى G2 إلى M Pool مستويات أعلى من Phospho-Rb و Cyclin B one ، مقارنة ب G1 Pool ، كما هو متوقع. كانت إشارة Cyclin D الواحدة ضعيفة ، ولكن مع ذلك كان من الممكن اكتشافها في G1 Pool ، ولا يمكن اكتشافها في G2 إلى M Pool.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تأخذ وقتك ، وتأكد من تجميع نظام الإزالة بشكل صحيح ، وأن جميع المواد والحلول. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل دورة الخلية ومقايسات بقاء الخلية واللطخات المناعية من أجل استجواب كيفية عمل المركبات العلاجية بطريقة تعتمد على مرحلة دورة الخلية.