تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة معدلات تسوس النسخ في الخلايا الليفية المتكاثرة والهادئة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية مثل ما إذا كانت التغييرات في التعبير الجيني ناتجة عن التغيرات في معدل اضمحلال النسخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر معلومات عن معدل اضمحلال النص ، وليس فقط وفرة النص.

لبدء البروتوكول ، قم بإنشاء مزارع متكاثرة وهادئة للأرومات الليفية. يجب أن تكون الخلايا الليفية المتكاثرة التربسينية بانتظام. يمكن إنشاء الثقافات الهادئة من خلال السماح للصفائح بالوصول إلى التقاء مع تغييرات متوسطة منتظمة.

أضف ActD 150 ميكرولتر إلى 10 ملليلتر متوسطة مسخنة مسبقا لجميع ألواح زراعة الخلايا المكررة البيولوجية. أضف ActD بتركيز 15 ميكروغرام لكل مليلتر من المتوسط. امزج المحلول جيدا.

استنشق الوسط القديم ، وأضف وسيطا يحتوي على ActD إلى الخلايا. لجمع عينة النقطة الزمنية الصفرية ، قم بالشفط برفق من وسط ActD والماصة بين خمسة و 10 ملليلتر من PBS الدافئ مسبقا على صفيحة 100 ملم ، وخمسة ملليلتر من المحلول للوحة 100 ملم ، ومليلترين لبئر من صفيحة من ستة آبار ، ومليلتر واحد لبئر من صفيحة 12 بئرا. استنشق بلطف PBS.

ثم أضف محلول الفينول جوانيدين إيزوثيوسيانات مباشرة إلى لوحة زراعة الأنسجة. ماصة خليط خلية محلول الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات لأعلى ولأسفل عدة مرات لعمل خليط متجانس. اجمع كل نقطة زمنية بعد مرور الوقت المناسب ، باستخدام الطريقة الموضحة سابقا.

احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لضمان الذوبان الكامل لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قدم النصوص الخاضعة للرقابة التي يمكن اكتشافها باستخدام المنهجية المستخدمة. أدخل هذه الضوابط في كل عينة بكمية وتركيز معروفين.

باستخدام ماصة ، انقل خليط محلول فينيل جوانيدين إيزوثيوسيانات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 ملليلتر. ثم أضف 0.2 مل من الكلوروفورم إلى خليط محلول فينيل جوانيدين إيزوثيوسيانات لكل مليلتر واحد من محلول فينيل جوانيدين إيزوثيوسيانات المستخدم. هز أنبوب الطرد المركزي الدقيق بقوة لمدة 15 ثانية ثم احتضان الكلوروفورم فينيل جوانيدين إيزوثيوسيانات.

بعد الحضانة ، قم بتدوير العينات عند 12 ، 000 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يجب فصل العينة إلى ثلاث طبقات. انقل الطبقة المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2.0 ملليلتر باستخدام ماصة دقيقة واحرص على عدم إزعاج الطور البيني أثناء هذه العملية.

تجاهل الطور البيني والكسور العضوية. ثم أضف حجما متساويا من 2-Propanol إلى الجزء المائي واقلب الأنبوب 10 مرات. أضف ما يصل إلى ميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل مليلتر من الجليكوجين المائي لكل 20 ميكرولتر من العينة ، خاصة إذا كان من المتوقع أن يكون العائد منخفضا.

احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بتدوير العينات. تأكد من أنه في نهاية الدوران ، ترسب الحمض النووي الريبي لتشكيل حبيبات في قاع الأنبوب.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها ، مع الحرص بشكل خاص على عدم إزعاج حبيبات الحمض النووي الريبي البيضاء. أضف مليلتر واحد من 75٪ الإيثانول لكل مليلتر واحد من كاشف محلول فينيل جوانيدين إيزوثيوسيانات لغسل الحبيبات. قم بتدوير العينات في 12 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق.

بعد إزالة معظم المادة الطافية ، استخدم ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول ولكن لا تزعج الحبيبات. يدور العينات لحبيبات كل الإيثانول الزائد. تكون حبيبات الحمض النووي الريبي أقل إحكاما في هذه الخطوة وتميل إلى الحركة.

بعد الدوران ، قم بإزالة كل الإيثانول الزائد من الأنبوب دون إزعاج الحبيبات. اترك حبيبات الحمض النووي الريبي تجف في الهواء لمدة خمس دقائق. أضف 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى حبيبات الحمض النووي الريبي وأعد تعليق الحبيبات في ماء خال من النوكلياز.

عالج عينات ميكرولتر واحد من Deanase لإزالة الحمض النووي ثم تعطيل Deanase والكاتيونات. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 ملليلتر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. حدد كمية الحمض النووي الريبي وتحقق من نقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

بعد التحقق من النقاء ، قم بتحليل الحمض النووي الريبي باستخدام هلام الاغاروز بنسبة 1٪ لتصور مدى التدهور. يجب أن يكون شريطان واضحان يمثلان 18S و 28S rRNA مرئيين بوضوح. إذا لم تكن هذه النطاقات مرئية ، فقد يتدهور الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، راقب وفرة النسخة في حصصات التجميع من الحمض النووي الريبي مقارنة بالمعيار الداخلي المسننة باستخدام qPCR في الوقت الفعلي. يمكن أيضا استخدام المصفوفات الدقيقة أو تسلسل الحمض النووي الريبي أو البقع الشمالية. تتوافق شدة التألق بمرور الوقت مع التعبير الجيني.

بينما تصبح الخلايا الليفية مثبطة للتلامس ، فإن الكولاجين 3A1 المشفر للنسخ ، وهو جين مهم جدا لإنشاء المصفوفة خارج الخلية المترسبة أثناء التئام الجروح يصبح أكثر استقرارا ولا يتحلل بسرعة. لا تنس أن العمل مع الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ومن المهم عدم تركه يلمس بشرتك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة معدلات اضمحلال النسخ في الخلايا الليفية المتكاثرة والهادئة.

يمكن أن تكون التغييرات في معدل اضمحلال النسخ آلية مهمة لتثليث الجينات.