أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان رابطة الدول المستقلة -prenyltransferase في الإشريكية القولونية

الهدف العام لهذا البروتوكول هو الإفراط في التعبير عن رابطة الدول المستقلة البشرية المحسنة للكودون وتنقيته في ظل ظروف غير متغيرة للطبيعة وفحص نشاطه الأنزيمي. يتم توضيح الإجراء مع رابطة الدول المستقلة طويلة السلسلة حقيقية النواة ديهيدرودوليتشيل ثنائي الفوسفات سينسيز ، أو DHDDS. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا لتخليق الأيزوبرينويد وتوفر رؤى رئيسية حول الآلية الفيزيولوجية المرضية لالتهاب الشبكية الصباغي المرتبط بالطفرات في DHDDS.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وموفرة للوقت. كما يمكن تعميمه لإنتاج كميات كبيرة من بروتينات رابطة الدول المستقلة الأخرى. ابدأ هذا الإجراء باستنساخ تعبير عن DHDDS البشري ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت A ، ميكروغرام واحد لكل مليلتر من DNase I ، وخليط مثبط للبروتين. بعد ذلك ، قم بتجانس الخلايا المعلقة باستخدام الخالط الزجاجي من التفلون. قم بتعطيل الخلايا باستخدام مفاعل مفاعل ميكرو أو ما يعادله عند 12 ، 000 إلى 15 ، 000 رطل لكل بوصة مربعة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمحللة الخلية عند 40 ، 000 مرة جم لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استعادة المادة الطافية التي تحتوي على الجزء القابل للذوبان. قم بتحميل المادة الطافية على عمود كروماتوغرافيا تقارب معدني يجملك بالكوبالت من خمسة إلى 10 ملم مع إيميدازول 10 ملليمول.

بعد التحميل في آلة كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع ، قم بإجراء غسيل شامل للعمود باستخدام المخزن المؤقت A في 10 ملليمولار إيميدازول من أجل تقليل ارتباط البروتين غير المحدد. ابدأ برنامج FPLC. قم بتقطيع البروتينات المعبر عنها بشكل مفرط باستخدام المخزن المؤقت A المكمل ب 250 ملليمولار إيميدازول.

بعد الشطف ، قم بإزالة الإيميدازول باستخدام 53 مل من عمود تحلية تحضيري متوازن مع المخزن المؤقت A. ثم أضف بروتياز TEV الموسوم بسداسي هيستيدين إلى البروتينات المملوءة لإزالة اندماج DHDDS الذي يحمل علامة سداسي هيستيدين. احتضن الخليط على أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، قم بتحميل البروتينات المشقوقة على عمود كروماتوغرافيا تقارب معدني متحرك بالكوبالت متوازن مع المخزن المؤقت A المكمل بخمسة مللي مولار إيميدازول.

اجمع التدفق لإزالة الثيوريدوكسين المشقوق والبروتياز TEV المسبومة بسداسي الهيستيدين. ركز التدفق إلى ما بين ثلاثة وأربعة ملليلتر باستخدام مرشح طرد مركزي مقطوع بوزن جزيئي 30 كيلودالتون. بعد ذلك ، قم بتحميل البروتين المركز على عمود كروماتوغرافيا استبعاد بحجم Superdex 200 متوازن مع المخزن المؤقت A للتنقية النهائية.

ضع العينات في رف 96 بئرا في مجمع الكسر. يميء البروتين كثنائي. حدد الكسور ذات الصلة من خلال مقارنة ملف تعريف الشطف بمنحنى معايرة العمود.

في هذه المرحلة ، قم بتقييم نقاء المستحضر باستخدام SDS-PAGE. أخيرا ، حدد تركيز البروتين اللازم للتجارب النهائية وتجميد التجميد السريع للبروتينات المركزة المنقاة في النيتروجين السائل. قم بتخزين الكميات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام.

لضمان قدرة البروتين على تحمل دورات التجميد والذوبان ، قم بإذابة كمية من البروتينات المجمدة. الطرد المركزي aliquot في 21 ، 000 مرة غرام لمدة 10 دقائق لإزالة الركام غير القابل للذوبان. بعد الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية.

بعد ذلك ، قم بتحميل البروتينات على عمود تحليلي Superdex 200 متوازن مسبقا مع TNXB باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء. راقب مضان التربتوفان للكشف عن ملف شطف البروتين. تأكد من وجود منحنى معايرة صالح لتقييم الوزن الجزيئي ، والذي يتوفر عبر الشركات المصنعة لأعمدة SEC.

لضمان نشاط البروتين المنقى ، قم أولا بخلط خمسة ميكرومولار من DHDDS المنقى مع 10 ميكرومولار FPP و 50 ميكرومولار C14 IPP. ابدأ التفاعل في المخزن المؤقت A مع 0.5 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم عند 22 إلى 30 درجة مئوية. اسحب 15 عينة ميكرولتر من التفاعل عند صفر أو ساعتين أو أربع أو ست ساعات بعد التبريد الفوري للتفاعل بإضافة 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت A مكملا ب 20 مليمولر EDTA.

ثم أضف ملليلتر واحد من 1-بوتانول المشبع بالماء والدوامة جيدا لاستخراج منتجات التفاعل. يمكن إيقاف البروتوكول هنا ، ويمكن الاحتفاظ بالعينات لقراءتها لاحقا. بعد ذلك ، أضف كوكتيل التلألؤ إلى العينات.

باستخدام عداد التلألؤ ، قم بقياس كمية منتجات التفاعل في مرحلة البيوتانول التي تشمل C14 مع النشاط الإشعاعي البالغ 15 ميكرولترا من التفاعل ، وهو ما يمثل النشاط الإشعاعي الكلي. أخيرا ، احسب صافي دمج C14 IPP في كل نقطة زمنية عن طريق حساب النسبة المئوية المستخدمة من إجمالي تركيزات C14 IPP ورسم النتائج كدالة للوقت. من المتوقع زيادة في صافي دمج الشراكة بين الوكالات المستقلة C14 بمرور الوقت.

عرض العينات التي تم الحصول عليها في كل خطوة من خطوات التنقية هنا. يظهر تحليل SDS-PAGE هذا التنقية التدريجية ل DHDDS ، مما ينتج عنه منتج عالي النقاء. يمثل هذا الكروماتوغرام نتائج كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي للإنزيم المنقى ، مما يكشف أن البروتين يتم ملاحظته فقط على أنه متجانس.

هنا ، يشير السهم إلى حجم الفراغ. يكشف اختبار النشاط التمثيلي المعتمد على الوقت أن دمج C14 IPP يرتفع بوضوح على مدى ست ساعات ، مما يتحقق من أن الإنزيم المنقى يعمل. بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء هذا المستحضر البسيط في غضون يومين إلى ثلاثة أيام ، مما ينتج عنه إنزيم عالي النقاء ونشط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الإفراط في التعبير عن رابطة الدول المستقلة وتنقيته من الإشريكية القولونية وقياس نشاطه بطريقة تعتمد على الوقت.