تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

الهدف العام من هذه التجربة هو التحقيق في فعالية العوامل السامة للجينات في الخلايا السرطانية باستخدام مقايسة الرحلان الكهربائي أحادية الخلية ، والتي تسمى أيضا مقايسة المذنب. هذا الإجراء هو معنى لقياس الدراسات السمية الوراثية الأربع. وهي قابلة للتطبيق على الإيفالات المختلفة ، مثل اختيار الدواء المرشح في وقت سابق والبحث الأساسي في تلف الحمض النووي والإصلاح.

توفر هذه التقنية طريقة مباشرة لتقييم تلف الحمض النووي كميا. وهي فعالة وسهلة الأداء وغير مكلفة نسبيا. قم بإعداد الاغاروز لطلاء الشرائح عن طريق إذابة واحد بالمائة من الاغاروز في الميكروويف لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أو حتى يذوب الاغاروز تماما.

اغمس شريحة مجهر زجاجي في الاغاروز واستخدم منديلا خاليا من النسالة لمسح جانب واحد من الشريحة. ضع الشريحة على سطح مستو حتى تجف في الهواء. يجب تشكيل فيلم الاغاروز الشفاف بعد التجفيف.

ضع الشرائح المطلية في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يتم تقييم التأثير العلاجي للعلاج الكيميائي في خلايا الورم الدبقي U251 المزروعة في وسط DMEM / Ham F-12 المكمل بنسبة 10٪ FBS و 100 وحدة لكل مليلتر من البنسلين و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. هضم الخلايا باستخدام مليلتر واحد من التربسين لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بتحييد التربسين باستخدام وسط DMEM / Ham F-12 مع FBS.

اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل. وتدور عند 300 مرة جم لمدة أربع دقائق. استنشق الوسط.

الخلايا في اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في 1x PBS. الخلايا ويجب تحضيرها مباشرة قبل بدء الفحص. ويجب التعامل معها في الظلام.

كل ذلك في ضوء خافت لمنع التلف. اجمع بين تعليق الخلية مع واحد بالمائة من الاغاروز المنصهر ونقطة الانصهار المنخفضة بنسبة حجم من واحد إلى 10. تخلط بلطف عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

وعلى الفور ماصة 30 ميكرولتر على شريحة. استخدم شريحة طرف الماصة لنشر خليط الاغاروز لضمان تكوين طبقة رقيقة. ضع الشرائح بشكل مسطح عند أربع درجات مئوية ، في الظلام ، لمدة 10 دقائق.

اغمر الشرائح في محلول تحلل أربع درجات مئوية ، في الظلام لمدة ساعة إلى ليلة وضحاها. بالنسبة لمقايسة المذنب القلوي ، قم بإزالة الشرائح برفق من محلول التحلل ، واستنزاف السائل الزائد ، واغمر الشرائح برفق في AES ، في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بفك الحمض النووي. أضف AES المبرد مسبقا في صينية منزلق الرحلان الكهربائي.

لا تتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح. ضع الشرائح بالداخل وقم بتغطيتها بغطاء. اضبط جهد مصدر الطاقة على فولت واحد لكل سنتيمتر وقم بتشغيله عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

عند اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بتصريف AES الزائد من الشرائح. اغمر الشرائح برفق مرتين في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، اغمر الشرائح برفق في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بالنسبة لمقايسة المذنب المحايد ، قم بإزالة الشرائح برفق من محلول التحلل ، واستنزاف السائل الزائد ، واغمرها برفق في NES في الظلام ، عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف NES المبرد مسبقا في صينية الشريحة الكهربائية، بحيث لا تتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح. ضع الشرائح بالداخل وقم بتغطيتها بغطاء.

اضبط جهد مصدر الطاقة على فولت واحد لكل سنتيمتر وقم بتشغيله عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. استنزاف المخزن المؤقت الزائد من الشرائح. اغمر الشرائح برفق في محلول ترسيب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، اغمر الشرائح برفق في 70٪ من الإيثانول في الغرفة المعتدلة لمدة 30 دقيقة. ابدأ هذا الإجراء بتجفيف الشرائح في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. بعد ذلك ، ضع 50-100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الحمض النووي الفلوري الأخضر على الاغاروز المجفف لكل شريحة ، وصمة عار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

اشطف الشرائح لفترة وجيزة بالماء المقطر ، وجففها تماما عند 37 درجة مئوية في الظلام. قم بإجراء الحصول على الصور وتحليلها مباشرة بعد تلطيخ شرائح المذنب. ضع شريحة تحت مجهر الفلورسنت مع حامل شرائح.

حدد العدسة الموضوعية 10X ، وتأكد من أن جل الاغاروز يواجه العدسة الموضوعية. التقط صورا عشوائيا من كل شريحة مذنب ملطخة. تجنب الحواف والمناطق المحيطة بأي فقاعات هواء.

تأكد من توزيع كل ذيل مذنب أفقيا. يجب أن تنشأ رؤوس المذنب من اليسار والذيل من اليمين. احفظ كل صورة بتنسيق ثنائي مع صبغة الحمض النووي الساطعة والخلفية الداكنة.

لتحليل الصور ، قم أولا بتحميل جميع الصور إلى برنامج فحص المذنب ، باستخدام الزر تحديد الملفات المراد تحليلها ، الموجود على يسار شريط الأدوات. يجب أن تظهر نافذة عرض الصورة. ارسم إطار قياس على الشاشة ، واضبط حجمه وفقا لمذنب الخلية.

انقر فوق ضبط لإعداد عتبة الرأس والمذنب والذيل ، وفقا للصورة. ثم انقر فوق بدء القياسات. حدد خلية باستخدام الإطار وقم بتنشيط القياس بالنقر فوق زر فحص المذنب.

ستظهر صورة الكثافة في نافذة ملفات التعريف، مع معلمات القياس المحددة. احفظ النتائج بالنقر فوق الزر "نتائج المتجر". تحليل ما لا يقل عن 50 خلية لكل علاج.

تظهر نتائج فحوصات المذنب القلوي والمحايد أن ذيول مذنبات خلايا UT51 المعالجة بالدوكسوروبيسين كانت أطول ولديها كثافة أعلى من الحمض النووي ، مما يشير إلى تراكم كبير للحمض النووي المجزأ. أظهر التحليل الكمي لمقايسة المذنب القلوي أو المحايد زيادة كبيرة في تكوين ذيل المذنب ، بعد علاجات دوكسوروبيسين ، مما يشير إلى تلف الحمض النووي. أدى العلاج المركب لمثبط PARP ، أولابوريب ، وعامل مؤلكل ، تيموزولوميد ، إلى تعزيز تلف الحمض النووي بشكل كبير في خلايا الورم الدبقي ، والذي ينعكس من خلال زيادة طول وشدة إشارة ذيل المذنب.

أولابوريب وحده ، لم يدخل تلف الحمض النووي. حيث أنه عزز التأثير السام الجيني ل temozolomide. أظهرت الصور التمثيلية لخلايا الورم الدبقي تحت العلاجات الفردية والمركبة ذيول المذنبات الأطول والأكثر كثافة للخلايا المعالجة بالتيموزولوميد والأولابوريب.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السمية الجينية لقياس فواصل سلسلة الحمض النووي في العديد من أنواع الخلايا القيثرة. مثل الخلايا المستنبتة أو الخلايا المعزولة عن الكائنات الحية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة المذنب للتحقيق في فعالية عامل سام للجينات على مستوى الخلية الواحدة. لا تنس أن العمل مع كاشف الضرر يمكن أن يكون خطيرا للغاية. ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات ، أثناء إجراء هذا الإجراء.