ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

الهدف العام من هذا الاختبار هو مراقبة تأثير العدوى الفطرية في الكائن الحي النموذجي C.Elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الميكانيكية الرئيسية في مجال الأمراض المعدية ، مثل عوامل ضراوة مسببات الأمراض ، والمؤثرات المناعية المضيفة ، وكذلك اكتشاف الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نظام قابل للتتبع تجريبيا لدراسة تفاعلات المضيف والممرض من كلا الوجهتين.

إنه نظام سريع وسهل وفعال من حيث التكلفة. على الرغم من أن هذه الطريقة بالذات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمسببات الأمراض الفطرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العوامل المعدية الأخرى ، مثل البكتيريا أو حتى الكائنات الحية المتعددة لدراسة التفاعلات الميكروبية في مضيف حي. لعمل قطف دودي ، قم بقص قطعة من سلك الألمنيوم بطول 1.5 سم ثم أدخل بعناية ما يقرب من 0.5 سم من السلك في طرف ماصة باستور.

باستخدام موقد بنسن أو مصباح كحولي، قم بإذابة طرف الماصة الزجاجية عن طريق تدويره ببطء في اللهب حتى يلتصق السلك بإحكام بالماصة دون المساس بالشكل الأصلي لطرف الماصة. أخيرا ، باستخدام الملقط ، قم بثني نهاية السلك بعناية لإنشاء حلقة صغيرة. لنقل كميات كبيرة من الديدان بسرعة إلى ألواح جديدة ، استخدم ملعقة لقطع قطعة من أجار NGM تحتوي على الديدان المحددة.

ثم قم بإزالة القطعة المقطوعة وضعها ووجهها لأسفل على حافة رقعة OP50 على طبق جديد. لنقل الديدان بشكل فردي ، قم بإشعال السلك الموجود في الدودة حتى يصبح لونه أحمر ثم أخرجه من اللهب واتركه ليبرد لبضع ثوان. باستخدام السلك الموجود على المعول ، اكشط رقعة ثقافة OP50 المزروعة على اللوحة الجديدة برفق ، وقم بتغطية السلك الموجود على الانتقاء.

الثقافة اللزجة التي تغطي طرف السلك تجعل الديدان تلتصق بطرف الحفرة. وبالتالي ، استخدم حركة الضرب لالتقاط الديدان المحددة برفق. بمجرد جمع الديدان المختارة ، ضعها على طبق جديد عن طريق تمرير الثقافة برفق عبر الأجار.

ثم ضع السلك في اللهب لإزالة الثقافة المتبقية على المعول. ضع ما يقرب من 20 بالغا إما عن طريق قطفها أو تقطيعها على طبق به 50 ميكرولترا من سلالة الإشريكية القولونية OP50. لجمع البيض بعد يوم إلى يومين ، قم بإغراق اللوحة ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت M9.

ثم باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، قم بتحريك المحتويات الموجودة على صفيحة الأجار برفق لتحرير البالغة أو البيض الملتصق ب OP50. اجمع كل السائل الذي يحتوي على البيض والبالغين. انقل محلول M9 و OP50 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

الطرد المركزي الأنبوب عند 2 ، 100 × جم لمدة دقيقتين. ثم استنشق ما يقرب من تسعة ملليلتر من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. بعد ذلك ، استخدم ملليلترين من الماء المعقم ، ومليلتر واحد من المبيض ومليلتر واحد من 0.25 مولار هيدروكسيد الصوديوم لإعادة تعليق الحبيبات.

تخلط بلطف عن طريق الانعكاس حتى تظهر ما يقرب من 70٪ من البالغة متحالفة. عادة ما يظل البيض سليما خلال علاج التبييض القصير هذا بسبب قشرته. من الأهمية بمكان أن تكون كمية التعرض للتبييض محدودة في هذه الخطوة.

التعرض المطول للتبييض سوف يدمر البيض. إذا فشل تحضير البيض ، فقم إما بالحد من مدة التعرض للتبييض أو تخفيف المحلول. جهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 990 × جم لمدة دقيقتين.

استنشق المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت M9. بعد الدوران مرة أخرى وإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، استخدم 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 لإعادة تعليق الحبيبات.

قم بتوزيع ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من YPD في أنبوب اختبار معقم ، واستخدم حلقة معقمة لتلقيحها بمستعمرة واحدة من المبيضات البيض. ضع الأنبوب على أسطوانة دوارة عند 30 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة تقريبا. قم بتسمية أنبوب ميكرو فوج واحد سعة 1.5 مليلتر لاحتواء المطثية البيضاء وآخر لاحتواء OP50 ، ثم سجل وزن كل أنبوب فارغ.

انقل 500 ميكرولتر من ثقافة C.albicans بين عشية وضحاها إلى الأنبوب المسمى C.Albicans. و 1500 ميكرولتر من ثقافة OP50 الليلية في الأنبوب المسمى OP50. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 16 ، 100 × جم ، ثم استنشق المادة الطافية دون إزعاج الكريات.

استخدم 500 ميكرولتر من الماء المعقم لإعادة تعليق كل حبيبات. ثم الطرد المركزي الأنابيب عند 16 ، 100 × جم لمدة خمس دقائق. استنشاق المادة الطافية دون إزعاج الكريات.

ثم سجل الوزن النهائي لأنابيب الطرد الدقيق. حدد وزن كل حبيبات عن طريق طرح الوزن الأولي لأنابيب الطرد الدقيق من الوزن النهائي. باستخدام الماء المعقم, أعد تعليق حبيبات C.albicans إلى 10 ملليغرام لكل مليلتر و OP50 بيليه إلى 20 ملليغرام لكل مليلتر.

ثم اصنع مزيجا رئيسيا من العدوى عن طريق الجمع بين 10 ميكرولتر من محلول 50 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. 2.5 ميكرولتر من ثقافة OP50. 0.5 ميكرولتر من ثقافة C.Albicans ، و 7 ميكرولتر من الماء المعقم.

بالنسبة للوحات التحكم ، قم بإنشاء مزيج رئيسي عن طريق استبدال حجم C.albicans culture بالماء المعقم. ثم استخدم ماصة دقيقة لزرع 20 ميكرولترا من مزيج العدوى أو محلول التحكم OP50 في وسط ألواح NGM. بعد تحضير البيض كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، عد البيض تحت نطاق التشريح.

واستخدم M9 لتخفيف محلول البيض حتى يتم تحقيق تركيز ما يقرب من خمس إلى ست بيضات صحية لكل ميكرولتر. باستخدام ماصة، قم بتوزيع عينة سعة 20 ميكرولترا تحتوي على حوالي 30 بيضة على صفيحة NGM محضرة في المنطقة الواقعة بين المزرعة البكتيرية وجانب اللوحة. احتضان الصفائح على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

ثم ، تحت مجهر التشريح ، احسب عدد الديدان البالغة الحية والميتة على كل لوحة. النظر في أن ميت إذا لم يستجب للضغط على رأسه بواسطة سلك ألومنيوم أو النقر على اللوحة. احسب أيضا عدد الديدان باستخدام Dar وتأكد مما إذا كان مصابا بالدار عن طريق النقر بسرعة على اللوحة على مسرح مجهر التشريح.

ستتحرك التي لا تحتوي على Dar للخلف على الفور ، بينما ستحتاج التي تحتوي على Dar إما إلى جولات متكررة من النقر لعكس اتجاهها أو لن تفعل ذلك على الإطلاق. كل يومين ، انقل أي ديدان بالغة متبقية عن طريق التقاط الديدان على عدوى جديدة أو لوحة تحكم. في هذه المرحلة ، إذا لزم الأمر ، قم بإجراء اختبار البقاء على قيد الحياة عن طريق تتبع عدد الديدان الحية والميتة والمفقودة كل يوم.

من المهم نقل الديدان كل يومين على الأقل. هذا يضمن عدم الخلط بين الديدان البالغة التي يتم تسجيلها في هذا الاختبار عند ذريتها. تعرضت المطثية ايليجانس لالمطثية البيضاء على مدى ستة أيام ولوحظت علامات العدوى وتطور المرض والوفاة.

يكون النمط الظاهري Dar أكثر وضوحا بحلول اليوم الرابع من اختبار البقاء على قيد الحياة كما لوحظ من خلال منطقة شرجية بارزة غير مرئية في غير المصاب. من المعروف أيضا أن الديدان المصابة بالمطثية البيضاء تظهر تورما في منطقة الفرج. في كلتا الحالتين ، لا تستطيع الدودة التخلص من العدوى بعد الوصول إلى هذه المرحلة.

من أجل تصور استعمار C.Albicans في تجويف الأمعاء ، تم تغذية الديدان من النوع البري C.albicans الموسومة ب RFP والتي تتسبب في تألق مناطق الاستعمار باللون الأحمر. C.albicans يستعمر تجويف الأمعاء بحلول اليوم الثالث من الفحص. كما هو موضح هنا ، أظهرت الديدان المصابة انتفاخا معويا أكثر حدة مما لوحظ في السيطرة غير المصابة.

في هذه التجربة ، تم اختبار قدرة الديدان على النجاة من العدوى الناجمة عن المطثية البيضاء الخبيثة efg1 / efg1 cph1 / cph1 المتحولة المزدوجة. تعيش الديدان المصابة بالمتحولة المزدوجة إحصائيا لفترة أطول بكثير من الضوابط. مما يشير إلى أن هذين الجينين مطلوبان لضراوة C.albicans ضد C.Elegans.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بكل جزء من هذه التقنية في ساعة إلى ساعتين كل يوم من عمر الدودة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المرء قد يستخدم عوامل معدية. لذلك يجب ممارسة احتياطات السلامة البيولوجية المناسبة.

يمكن إجراء تعديلات طفيفة على هذا الإجراء الأساسي ، مثل إدخال عوامل ميكروبية إضافية من أجل دراسة التفاعلات الميكروبية في سياق المضيف الحي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض المعدية لاستكشاف الفوعة الميكروبية ، وآليات الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ، فضلا عن اكتشاف عوامل جديدة مضادة للميكروبات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحفاظ على C.Elegans ومعالجتها واستخدام الكائن الحي لدراسة تفاعلات الميكروبات المضيفة على المستوى الجزيئي.

لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض الميكروبية والكواشف الكيميائية ، مثل أزيد الصوديوم ، يمكن أن يكون خطيرا ويجب استخدام احتياطات السلامة المناسبة مثل معدات الوقاية الشخصية وطرق التخلص من النفايات.