تجزئة سوبسيلولار للتنشيط إيرك عند معاملة الببتيد المستمدة من الميتوكوندريا

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد سلسلة الإشارات النهائية المشاركة في الخلايا المحفزة بالببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الببتيد المشتق من الميتوكوندريا مثل مسارات الإشارات المتضمنة ، وأين يحدث ذلك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مستقيمة وسهلة الأداء نسبيا.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما فحصنا إشارات ERK بوساطة الإنسان والتي أعطتنا معلومات محدودة عن الحقائق النهائية أعطتنا طريقة Kersher Subscale فكرة أفضل عن دور الإشارات بوساطة الإنسان. في اليوم الثالث بعد الطلاء والغسيل مرتين عشرة إلى السادس ، خلايا SH-SY5Y أو HEK293 وفقا لبروتوكول النص.

قم بإذابة ببتيدات الإنسان S14G في الماء المقطر المصفى بنقطتي صفر بميكرون. وأعد تشكيلها كمحلول مخزون مليمولاري واحد. Aliquot الوسط المحتوي على المصل أو الخالي من المصل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف محلول مخزون الببتيد البشري بدرجة حرارة الغرفة لعمل تركيز عمل.

استبدل الوسط الموجود في الخلايا على الفور بستة ملليلتر من محلول الببتيد. واحتضان الخلايا لفترة زمنية مناسبة. استخدم 10 مل من PBS المثلج لغسل الخلايا مرتين.

ثم اكشط الخلايا من اللوحة في خمسة ملليلتر من PBS المثلج. ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التجزئة المثلج واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 250 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اجمع المادة الطافية كجزء سيتوبلازمي واحتفظ بالحبيبات للجزء النووي.

جهاز الطرد المركزي للطافية لإزالة الحطام الخلوي والملوثات الأخرى عند 18000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. هذا هو جزء السيتيزول.

أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول الغسيل المثلج البارد وقم بالطرد المركزي للمحلول عند 250 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واستخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج النووي المثلج لإعادة تعليق الحبيبات. ثم صوتنة العينة على الجليد 10 مرات.

الطرد المركزي العينة مرة أخرى. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. لعزل جزء الميتوكوندريا الخام ، استخدم 10 ملليلتر من PBS المثلج لغسل الخلايا في كل طبق 10 سم.

ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS المثلج واستخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا. نقل معلقات الخلية إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

استنشق PBS واستخدم ملليلتر واحد من عازل الميتوكوندريا المثلج لإعادة تعليق الحبيبات. ثم باستخدام مدقة مطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين على الجليد ، قم بتجانس الخلايا ب 25 ضربة من الخالط ملليلتر. انقل المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بالطرد المركزي للعينة عند 600 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة النوى والخلايا غير المكسورة.

ثم اجمع المادة الطافية ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وقم بالطرد المركزي للمحلول عند 7000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات ب 200 ميكرولتر من عازل الميتوكوندريا المثلجة ونقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 7000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد تكرار الغسيل ، استخدم 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت RIPA لإعادة تعليق الحبيبات واحتضان التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 16000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. انقل المادة الطافية ، وهي جزء الميتوكوندريا ، إلى أنبوب جديد.

تحديد وتنفيذ النشاف الغربي وفقا لبروتوكول النص. باستخدام الإجراء الموضح في هذا الفيديو ، تراجعت خلايا HEK293 و SH-SY5Y بواحد و 100 ميكرومولار S14 G humanin ، وهو نظير إنساني قوي. وتم تحليل الشكل الكلي والفسفوري ل ERK12 في الثيانين 202 ، والتيروزين 204 من مستخلصات البروتين الكلية.

كما هو موضح هنا ، أظهر علاج الإنسان S14G زيادة في فسفرة ERK12 وموقع الثيانين التنظيمي -202 ، التيروزين 204. لفهم هدف تنشيط ERK12 بوساطة S14G humanin ، تم تحليل التوطين الخلوي الفرعي ل ERK12 الكلي والفسفوري بعد العلاج البشري S14G. كما هو موضح في هذه البقع الغربية ، في خلايا HEK293 ، زاد ERK الفسفوري في كل من السيتوبلازم والنواة ولكن ليس في الميتوكوندريا.

ذلك ، في خلايا SH-SY5Y ، انخفض ERK الفسفوري في نواة السيتوبلازم والميتوكوندريا. مما يشير إلى أن فسفرة ERK بوساطة الإنسان S14G قد تلعب دورا مختلفا في أنواع الخلايا المختلفة والظروف المختلفة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التجزئة النووية للخلية في ساعة واحدة ويمكن إجراء تجزئة الميتوكوندريا في ساعة واحدة و 30 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع العينات على الجليد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى بما في ذلك هطول الأمطار المناعي المشترك وقياس الطيف الكتلي من أجل فهم الأهداف النهائية لجزيئات الإشارات.