تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير الكروماتين من عضلة الهيكل العظمي للفأر البالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تنظيم الجينات وألياف العضلات الهيكلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحضير الكروماتين من الدرجة ChIP من عضلة الهيكل العظمي للفأر.

نسيج مقاوم جسديا يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نسعى لتوصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء ضمور العضلات المفصلي بالجلوكو ، والذي يتطلب تحديد مستقبلات الجلوكوز المفصلية ، ومواقع ربط الحمض النووي في ألياف العضلات والهيكل العظمي للفأر. سيوضح الإجراء شيلبي جوشي ، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبرنا.

لبدء هذا الإجراء ، استرجع عضلات الأطراف الخلفية المجمدة أو التشريح حديثا. بعد ذلك ، قم بفرم العضلات في أنبوب اختبار سعة ملليلترين ، يحتوي على مليلتر واحد من المخزن المؤقت المنخفض التوتر المثلج لإعداد متجانس للقطع الصغيرة ، باستخدام مقص ناعم. بعد ذلك ، اترك الأنبوب يهتز على محرض أعلى مقاعد البدلاء عند أربع درجات مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب دائري القاع سعة 14 مليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت البارد منخفض التوتر. قم بتجانس الأنسجة المفرومة باستخدام خالط الأنسجة الميكانيكي لمدة 15 إلى 30 ثانية. بعد ذلك ، انقل الجانس إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

أضف عازلة منخفضة التوتر الباردة للحصول على 10 ملليلتر من العينة وإصلاح التجانس قبل الشروع في الماوس التالي. في هذا الإجراء ، أضف الفورمالديهايد إلى العينة للحصول على تركيز نهائي بنسبة 1٪. ثم يرج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف الجلايسين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.125 مولار في كل أنبوب لإيقاف التثبيت. ورجها لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتجانس المحللة الثابتة باستخدام تراجع فضفاض.

ثم قم بنقله إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 1000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على النوى والحطام الخلوي. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الطازج منخفض التوتر. قم بتصفية المحللة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.

باستخدام طرف الماصة ، اغسل الفلتر بمليلتر واحد من المحلول المؤقتة البارد منخفض التوتر. بعد ذلك ، أعد تصفية المرشح من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. بعد ذلك ، انقل المرشح إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

وجهاز الطرد المركزي عند 1000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على الحبيبات النووية. بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت منخفض التوتر لتجميع الكريات الثلاثة ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 إلى ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 1000 غرام لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتقييم حجم الحبيبات النووية بالمقارنة مع الأنابيب التي تحتوي على حجم معروف من السائل وأعد تعليقها في مخزن صوتنة يصل إلى ثلاثة إلى أربع مرات من الحجم النووي المعبأ. بعد ذلك ، صوتنة التعليق لمدة 10 إلى 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، باستخدام مكبر صوت. الطرد المركزي للعينة الصوتية ونقل الكروماتين الطافي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

لإزالة الارتباط المتقاطع ، خذ 30 ميكرولترا من الكروماتين في أنبوب اختبار سعة 1.5 ملليلتر وأضف 20 ميكرولترا من خمسة كلوريد صوديوم مولار و 450 ميكرولتر من الماء. أكمل الحجم إلى 500 ميكرولتر واحتضنه عند 65 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإجراء علاج باستخدام ميكرولتر واحد من Proteinase K ، و 10 ميكرولتر من اثنين من التروس المولار عند درجة الحموضة 6.8 و 10 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA لمدة ساعة واحدة عند 42 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإجراء استخلاص منتظم للكلوروفورم الفينول والكلوروفورم وترسيب الحمض النووي بحجم واحد من أسيتات الصوديوم ومجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة عند سالب 80 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها عند سالب 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتكسير الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 13 ، 500 جم لمدة 15 دقيقة. صب المادة الطافية واغسل الحبيبات جيدا بالإيثانول البارد 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

ثم صب المادة الطافية وجفف الحبيبات بالهواء. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في الحجم الأصلي للمخزن المؤقت tris HCl EDTA. قم بقياس تركيز الحمض النووي في مقياس الطيف الضوئي بواسطة المواد الماصة عند 260 نانومتر ، 280 نانومتر.

بعد ذلك ، قم بسحب 500 إلى 1000 نانوجرام من الحمض النووي مع سلم بحجم الحمض النووي على ممرات منفصلة من هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪. وإجراء الرحلان الكهربائي لتقييم حجم جزء الكروماتين. للتحسين ، تم إجراء التجانس إما لمدة 15 ثانية أو 45 ثانية بسرعتين ، 18 ، 000 و 22 ، 000 دورة في الدقيقة.

في جميع الظروف ، يمكن فصل النوى عن بقايا الأنسجة ، لكن العائد كان مثاليا باستخدام سرعة أقل. يمكن أيضا تحضير النوى عن طريق التدوين لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. لكن التجانس الميكانيكي هو الطريقة المفضلة حيث يمكن تحقيق الإنتاجية المثلى للنوى في أقل من 15 ثانية ، مما يسمح بكسب كبير من الوقت ، خاصة إذا كان لا بد من معالجة عينات متعددة.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن عزل ما يصل إلى 2.7 مرة 10 إلى النوى السبع من 500 ملليغرام من الأنسجة لتوليد 100 ميكروغرام من الكروماتين. يعطي الكروماتين المحضر بهذه الطريقة نتائج نظيفة وعالية الجودة في تجارب تسلسل ChIP. كما يتضح من المستويات العالية من الأسيتيل K27 من هيستون H3 و RNA polymerase 2 في موضع ديزموند المعبر عنه العضلات.

تظهر خصوصية ألياف العضلات من خلال إشارة منخفضة أو غائبة في مواقع Pecam1 و Vcam1 التي لا يتم التعبير عنها في العضلات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم غمر مسبار الخالط بشكل صحيح في العينة لتجنب الرغوة ، وتنظيف المسبار بين العينات ، وتحسين تجزئة الكروماتين. تم استخدام الكروماتين المحضر بهذه الطريقة بنجاح من أجل ChIP لرسم خريطة لشغل عامل النسخ على مستوى الجينوم ويجب أن يكون مناسبا أيضا لتقنيات التقاط تأكيد الكروماتين.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال علم الجينوم ، لاستكشاف تنظيم الجينات في العضلات الهيكلية من الفئران. يمكن أيضا تطبيق الإجراء على العضلات من الفئران والخزعات من المرضى البشريين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التجانس الميكانيكي ، متبوعا بتنقية النوى الثابتة بالفورمالديهايد لتحضير الكروماتين من العضلات الهيكلية للترسيب المناعي.

لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد والفينول والكلوروفورم والبروتيناز K يمكن أن يكون خطيرا. يجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والنظارات. يجب تنفيذ الخطوات التي تنطوي على هذه الكواشف تحت غطاء محرك السيارة.