رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

الهدف العام لهذه المنهجية التحليلية المدمجة هو توفير معلومات حول كيفية استجابة الحويصلات الإفرازية في الخلايا لقوة فيزيائية ، مثل الضغط التناضحي خارج الخلية ، وكيف تؤثر تعديلات هذه العضيات بشكل أكبر على عملية إفراز الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل ، كيف تستجيب الحويصلات الإفرازية بشكل مباشر للتغيرات في البيئة خارج الخلية أو للعلاج من تعاطي المخدرات؟ تتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج في مراقبة التأثيرات المباشرة على المحتوى الحويصلي في الخلايا الحية ومعرفة التمييز بين التغيير في إطلاقها الكيميائي قبل وبعد علاج الإفراز الكريمي.

للحصول على سطح قطب قرصي مسطح ، ضع القطب الكهربائي في حامل المطحنة الدقيقة وقم بشطبة كل قطب كهربائي من ألياف الكربون بزاوية 45 درجة. بعد ذلك ، ضع علامة على الشعيرات الدموية للرجوع إليها في المستقبل حول كيفية تحديد موقع سطح قطب القرص بزاوية 45 درجة عند وضع القطب بالقرب من الخلايا لقياس إفراز الخلايا. لإجراء تسجيل أمبيرومتر في الخلايا المفردة ، قم بتركيب القطب الصغير لقرص ألياف الكربون المشطوف والمختبر حديثا في حامل القطب الكهربائي لمرحلة الرأس المستخدم مع بوتينسيوستات.

قبل الاستخدام ، ضع كل قطب كهربائي دقيق من ألياف الكربون في محلول اختبار لمراقبة حالة الدراسة الحالية باستخدام قياس الفولتامتر الدوري. لإجراء فحص دوري لقياس الفولتامتر ، قم بتطبيق شكل موجة جهد مثلث من سالب 0.2 فولت إلى موجب 0.8 فولت مقابل قطب مرجعي لكلوريد الفضة والفضة عند 100 مللي فولت في الثانية لضمان حركية التفاعل الجيدة. لتسجيل قياس التيار الكهربائي لإفراز الخلايا ، ضع طبق بتري مع خلايا الكرومافين المستنبتة في مخزن مؤقت متساوي التوتر على مجهر مقلوب في قفص فاراداي.

استخدم مرحلة التسخين المجهري للحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء تجارب الخلية. بعد ذلك ، استخدم أداة مشبك رقعة منخفضة الضوضاء لتطبيق جهد ثابت يبلغ 700 مللي فولت موجب في القطب الكهربائي العامل. لتسجيل إفراز الخلايا في خلايا الكرومافين ، قم برقمنة الإشارة عند 10 كيلو هرتز وقم بتطبيق مرشح بيسل داخلي منخفض التمرير عند كيلوهرتز لتصفية الإشارة المسجلة.

لاحظ أن قطب القرص البيضاوي يجب وضعه بشكل مسطح فوق الخلايا وبالتوازي مع سطح طبق بتري. أيضا ، يتم شطف الأقطاب الكهربائية في نفس يوم التجارب لضمان سطح قطب نظيف. لتحفيز إفراز الخلايا ، ضع ماصة زجاجية مملوءة بمحلول كلوريد الباريوم بخمسة ملليمولار على مسافة لا تقل عن 20 ميكرومتر من الخلية.

بعد ذلك ، ضع نبضة حقن مدتها خمس ثوان من محلول كلوريد الباريوم بخمسة مللي مولار على سطح الخلية لتحفيز إفراز الخلية. ضع الماصة الجذعية في المحلول وحفز إفراز الخلايا عن طريق تطبيق نبضة حقن الباريوم أثناء تسجيل عابرات التيار الأمبيرومتري لمدة ثلاث دقائق تقريبا. لمقارنة الاستجابات الخارجية في الظروف متساوية التوتر بالظروف مفرطة التوتر ، احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في محلول عازل مفرط التوتر.

بعد ذلك ، قم بتطبيق نبضة حقن الباريوم لتحفيز إفراز الخلايا ، وقم بإجراء ثلاث دقائق من التسجيل بالأمبيرومترية. للحصول على استجابة عكسية للخلايا ، احتضان الخلايا مرة أخرى لمدة 10 دقائق في محلول عازل متساوي التوتر. تحفيز الخلايا عن طريق تطبيق نبضة حقن الباريوم وإجراء ثلاث دقائق من تسجيل الاستجابة الخارجية للخلايا.

لتصنيع الأقطاب الكهربائية لقياسات الحجم الكمي الحويصلي ، قم بإعداد قطب كهربائي من ألياف الكربون بقطر خمسة ميكرومترات. تحت المجهر ، استخدم مشرطا لقطع ألياف الكربون التي تمتد من الطرف الزجاجي بحيث يتبقى 30 إلى 100 ميكرومتر فقط. استخدم لهب البوتان لتحضير طرف محفور باللهب من قطب ألياف الكربون.

للحصول على طرف قطب كهربائي أسطواني محفور بشكل متساو ، أمسك قطب ألياف الكربون الأسطواني الشكل أثناء تدويره. وضع ألياف الكربون الممتدة من الزجاج إلى الحافة الزرقاء لهب البوتان حتى يتحول طرف الكربون إلى اللون الأحمر. بعد النقش باللهب ، ضع القطب الكهربائي تحت المجهر لتقييم طرف القطب.

يجب أن يكون حجم طرف القطب المحفور حوالي 50 إلى 100 نانومتر في القطر. بعد ذلك ، أدخل القطب الكهربائي الدقيق الأسطواني ذو الطرف النانوي في محلول الإيبوكسي لمدة ثلاث دقائق متبوعا بغمس طرف القطب في محلول الأسيتون لمدة 15 ثانية. هذا يسمح للإيبوكسي بإغلاق مساحة الفجوة المحتملة بين ألياف الكربون والجدار الشعري للغاز العازل.

بينما يزيل الأسيتون الإيبوكسي من سطح قطب ألياف الكربون المحفور. لعلاج الإيبوكسي ، اخبزي الأقطاب الكهربائية في فرن طوال الليل على حرارة 100 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، اختبر تيار الحالة المستقرة لكل قطب كهربائي دقيق من ألياف الكربون باستخدام الفولتامتر الدوري.

بالنسبة للتجارب ، استخدم فقط الأقطاب الكهربائية التي تعرض تيار هضبة حوالي 1.5 إلى 2.5 نانو أمبير. لقياسات قياس التمبير داخل الخلايا ، ضع الخلايا تحت المجهر واستخدم نفس الإعدادات التجريبية للبوتينسيوستات. منع الضرر المادي الكبير للخلية.

أدخل القطب الكهربائي الدقيق الأسطواني النانوي في الخلية عن طريق إضافة قوة ميكانيكية لطيفة. يكفي فقط لدفع القطب الكهربائي عبر غشاء بلازما الخلية وإلى سيتوبلازم الخلية باستخدام معالج دقيق. بعد الإدراج ، ومع إغلاق غشاء الخلية حول القطب الأسطواني ، ابدأ التسجيل الأمبيرومتري في الموقع في الخلية الحية.

عند إمكانات الأكسدة المطبقة على القطب الكهربائي ، تمتص الحويصلات على سطح القطب وتتمزق عشوائيا. وبالتالي ، ليست هناك حاجة لأي نوع من التحفيز لبدء هذه العملية. لتحديد التأثير التناضحي على الحجم الكمي الحويصلي ، اجمع قياسات القياس الخلوي داخل الخلايا من مجموعة من الخلايا التي تم تحضينها في مخزن مؤقت متساوي التوتر وفي مخزن مؤقت مفرط التوتر باستخدام الحالة التجريبية.

يتم تقديم تأثير الأسمولية خارج الخلية على نشاط إفراز الخلايا على أنه تواتر أحداث إفراز الخلايا عندما يتم تحفيز خلايا الكرومافين بمحلول الباريوم في متساوي التوتر ، ثم مفرط التوتر ، وأخيرا في ظروف متساوية التوتر. تظهر هذه البيانات تثبيطا في نشاط إفراز الخلايا في الخلايا التي تعاني من الإجهاد التناضحي ويمكن تحقيق انتعاش جزئي بعد عودة الخلايا إلى بيئة متساوية التوتر. تظهر تجربة التحكم تواتر أحداث إفراز الخلايا بعد ثلاثة محفزات متتالية للباريوم في خلايا الكرومافين في ظروف متساوية التوتر.

هذا يدل على أن تحفيز الباريوم المتعدد خلال الإطار الزمني المستخدم في هذه التجارب يتسبب في انخفاض نشاط إفراز الخلايا عن طريق التحفيز المتتالي للخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ هذه الأساليب التحليلية المجانية التي تسمح لك بمقارنة كيفية تأثر الحويصلات الإفرازية وعملية إفراز الخلايا بالتغيرات في البيئة خارج الخلية.